定性免疫學(xué)檢驗(yàn)的性能驗(yàn)證與質(zhì)量控制.ppt

1、,楊方華,定性免疫學(xué)檢驗(yàn)的性能驗(yàn)證與質(zhì)量控制,CNAS-CL39：2012醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域的應(yīng)用說明： 檢驗(yàn)方法和程序的分析性能驗(yàn)證內(nèi)容應(yīng)參考試劑盒說明書上明確標(biāo)示的性能參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，至少應(yīng)包括：檢出限、符合率（采用國家標(biāo)準(zhǔn)血清盤或臨床診斷明確的陰陽性樣品各20份或與其他分析方法比對），精密度（包括重復(fù)性和批間精密度）；并應(yīng)明確檢驗(yàn)項(xiàng)目的預(yù)期用途，如篩查、診斷、確認(rèn)。,一、定性免疫試驗(yàn)的性能驗(yàn)證,篩查試驗(yàn) 診斷試驗(yàn) 確認(rèn)實(shí)驗(yàn) C50 C5 C95,性能驗(yàn)證相關(guān)概念,一份樣本，在多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中各有50%的幾率獲得陽性或陰性的結(jié)果時(shí)該分析物的濃度。對特定試劑， C5

2、0一旦確定，是恒定不變的。,臨界點(diǎn)（C50）濃度的定義,C50,一份樣本，在多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中有95%的幾率獲得陰性結(jié)果時(shí)該分析物的濃度。,C5 濃度的定義,C5,一份樣本，在多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中有95%的幾率獲得陽性結(jié)果時(shí)該分析物的濃度。,C95 濃度的定義,C95,質(zhì)控品：商用或自備，含陽性和陰性。 C50和C5（C50-20%）及C95（C50+20%）濃度樣本：用于重復(fù)性及最低檢出限驗(yàn)證，不少于40次檢測量。 臨床樣本或血清盤：用于準(zhǔn)確性驗(yàn)證，不少于50份陽性和陰性樣本。,性能驗(yàn)證的樣本準(zhǔn)備,純定性試驗(yàn)：采用濃度接近臨界值的分析物作為檢測材料，不宜采用陰性低值或強(qiáng)陽性樣本來評(píng)價(jià)定性檢測方法的不精

3、密度。 量值化定性試驗(yàn)：以COI（cut-off Index）或S/CO比值作為分析方法的精密度評(píng)價(jià)指標(biāo)。,（一）不精密度的驗(yàn)證,定性測定精密度分析質(zhì)量指標(biāo)為C5-C95濃度區(qū)間（亦即“灰區(qū)”），這一區(qū)間范圍C5020%。,純定性測定不精密度的評(píng)估方法,分析物濃度接近臨界值時(shí)的不精密度曲線,兩種不同方法的不精密度曲線比較,檢測試劑或系統(tǒng)的說明書可能會(huì)注明分析物的臨界濃度，但需驗(yàn)證。 如果臨界濃度未知，則可以將陽性樣本進(jìn)行一系列稀釋，然后將他們進(jìn)行重復(fù)檢測以確定能夠獲得50%陽性和50%陰性結(jié)果的那個(gè)稀釋度，這一稀釋度的分析物濃度即為臨界點(diǎn)（C50）。,如何獲得 “臨界點(diǎn)（C50）”,制備評(píng)價(jià)用

4、樣本 制備3份樣本：一份濃度為C50，一份為C50+20%，一份為C50-20%。 每份樣本的體積需保證40次或更多次重復(fù)檢測的需要。 評(píng)價(jià)方法 每份樣本檢測40次，確定每一份樣本結(jié)果為陽性和陰性的百分比。,純定性試驗(yàn)不精密度評(píng)價(jià)步驟,-20%+20%濃度范圍在C5-C95區(qū)間之內(nèi)；用該方法檢測，濃度超過C5020%的樣本檢測結(jié)果不一致；此結(jié)論錯(cuò)誤率5% ，需使用更寬濃度范圍的樣本（如30%）進(jìn)行另外的試驗(yàn)。,不精密度評(píng)價(jià)結(jié)果判斷-1,-20%+20%濃度范圍包含了C5-C95區(qū)間；用該方法檢測，濃度超過C5020%的樣本檢測結(jié)果一致,不精密度評(píng)價(jià)結(jié)果判斷-2,用該方法檢測，C50+20%的樣

5、本檢測結(jié)果一致，C50-20%的樣本不一定能得到一致結(jié)果；需要用低于C50更大百分率濃度的樣本（如-30%）進(jìn)行補(bǔ)充試驗(yàn)。,不精密度評(píng)價(jià)結(jié)果判斷-3,用該方法檢測，C50-20%的樣本檢測結(jié)果一致，C50+20%的樣本不一定能得到一致結(jié)果；需要用高于C50更大百分率濃度的樣本（如+30%）進(jìn)行補(bǔ)充試驗(yàn)。,不精密度評(píng)價(jià)結(jié)果判斷-4,有些定性免疫測定，如ELISA等，樣本的測定結(jié)果可以COI（cut-off Index）或S/CO比值來表示，檢測系統(tǒng)或試劑廠家會(huì)在其試劑說明書中給出試劑的批內(nèi)和批間變異，這對于對實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)試劑的精密度以及評(píng)估其室內(nèi)質(zhì)控的批間變異結(jié)果有參考價(jià)值。 分為批內(nèi)精密度評(píng)估和

6、批間精密度評(píng)估,數(shù)值化定性免疫測定的精密度評(píng)價(jià)方法,操作者必須熟悉檢測系統(tǒng)工作原理，了解并掌握儀器的操作步驟和各項(xiàng)注意事項(xiàng)，應(yīng)在評(píng)估階段維持儀器的可靠和穩(wěn)定。 用于評(píng)估試驗(yàn)的樣本一般常采用臨床實(shí)驗(yàn)室收集的血清(漿)樣本；當(dāng)實(shí)驗(yàn)室收集的樣本不穩(wěn)定或不易得到時(shí)，也可考慮使用穩(wěn)定的、以蛋白質(zhì)為基質(zhì)的商品物質(zhì)，如校準(zhǔn)品或質(zhì)控品。,精密度評(píng)估的基本原則（1）,評(píng)估精密度時(shí)，應(yīng)至少評(píng)估兩個(gè)濃度水平樣本的精密度。 所選樣本濃度應(yīng)在測量范圍內(nèi)有醫(yī)學(xué)意義，即至少有一個(gè)濃度在醫(yī)學(xué)決定水平左右，在定性測定，即為接近臨界水平的濃度。,精密度評(píng)估的基本原則（2）,評(píng)估方法：三個(gè)不同濃度的樣本，在一個(gè)測試批內(nèi)重復(fù)進(jìn)行至少

7、20次檢測，計(jì)算所得S/CO值的均值和SD，計(jì)算批內(nèi)CV%。 質(zhì)量控制：檢驗(yàn)時(shí)應(yīng)同時(shí)至少測一個(gè)質(zhì)控品。 判斷結(jié)論：應(yīng)試劑說明書所標(biāo)明的批內(nèi)變異。ELISA的批內(nèi)變異CV%應(yīng)10%。,批內(nèi)精密度的評(píng)估,評(píng)估方法：三個(gè)不同濃度的樣本，在10天以上時(shí)間內(nèi)單次重復(fù)進(jìn)行至少20批檢測，計(jì)算所得S/CO值的均值和SD，計(jì)算批間CV%。 質(zhì)量控制： 判斷結(jié)論：應(yīng)試劑說明書所標(biāo)明的批間變異。 ELISA的批間變異CV%應(yīng)15%。,批間精密度的評(píng)估,檢測限（limit of detection）是指檢測方法可檢測出的最低被測量濃度，也稱檢測低限（lower limit of detection）或最小檢出濃度（

8、minimum detectable concentration），有時(shí)也稱為分析靈敏度（analytical sensitivity）。 如前所述，分析物濃度位于C5-C95區(qū)間之外（小于C5或大于C95）時(shí)，候選方法對同一樣本的重復(fù)性檢測將得到相同結(jié)果。因此，C95代表了某一試劑可以測出的最低被測量濃度。,（二）檢出限的驗(yàn)證,樣本選擇：評(píng)估試劑分析靈敏度所使用的樣本，如檢測項(xiàng)目有國家參考品，則可使用國家參考品或經(jīng)國家參考品標(biāo)化的參考品進(jìn)行檢測，如沒有國家參考品，則使用可以溯源或量化的樣本，如國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，或與國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溯源的樣本。 驗(yàn)證方法：處于測定下限濃度（C95）的樣本，重復(fù)檢測20

9、次，應(yīng)至少有18次以上為陽性反應(yīng)。,檢出限的驗(yàn)證方法,驗(yàn)證方法及指標(biāo)： 以與臨床診斷、金標(biāo)準(zhǔn)方法和標(biāo)準(zhǔn)血清盤的檢測比較來評(píng)價(jià)，常以敏感性（包括臨床敏感性）/特異性（包括臨床特異性）和陽性符合率/陰性符合率來表示。,（三）準(zhǔn)確度驗(yàn)證,臨床敏感性：在患有明確臨床疾病的患者中，其檢測結(jié)果呈陽性或者超過正常值范圍的比率 （即出現(xiàn)陽性結(jié)果和確定患者患病）。 臨床特異性：在沒有特定臨床疾病的患者中，其檢測結(jié)果呈陰性或者在正常值范圍內(nèi)的比率。,臨床特異性和臨床敏感性,陽性預(yù)測值：即測定為陽性的標(biāo)本實(shí)際上為陽性的可能性。 =真陽性/（真陽性+假陽性）100% 陰性預(yù)測值:則為一份給出陰性結(jié)果的樣本實(shí)際上為陰性

10、的可靠性。 = 真陰性/（真陰性+假陰性）100%,陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值,敏感性、特異性和陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值的計(jì)算,作為篩查試驗(yàn)，檢測的敏感性應(yīng)95%；作為診斷試驗(yàn)，檢測敏感性和特異性均應(yīng)95%；作為確認(rèn)試驗(yàn)特異性應(yīng)98%-99%。,定性免疫檢驗(yàn)項(xiàng)目敏感性、特異性要求,如果沒有可用的診斷標(biāo)準(zhǔn)，那么需提供待評(píng)價(jià)試劑與某一已驗(yàn)證方法進(jìn)行比較的結(jié)果，在這種情況下，則不能夠計(jì)算敏感性和特異性，而是計(jì)算陽性符合率和陰性符合率。 這種計(jì)算反映的并非方法的準(zhǔn)確度，而是待評(píng)價(jià)試劑和已驗(yàn)證方法的一致性程度。,陽性符合率和陰性符合率,待評(píng)價(jià)試劑與已驗(yàn)證方法相比較進(jìn)行陽性符合率和陰性符合率的計(jì)算,陽性符合率和

11、陰性符合率的計(jì)算,陽性符合率= a/(a+c) 100%。 陰性符合率= d/(b+d) 100%。 總符合率=(a+d)/(a+b+c+d)100%。,第三方質(zhì)控品 檢測系統(tǒng)配套質(zhì)控品 自制質(zhì)控品,質(zhì)控品的來源,二、檢驗(yàn)結(jié)果質(zhì)量的保證-室內(nèi)質(zhì)控,基質(zhì)：應(yīng)盡量選擇人血清基質(zhì)，動(dòng)物源性的基質(zhì)由于人體內(nèi)有大量的異嗜性抗體的存在引起假失控。稀釋液也應(yīng)用人血清，凍干品復(fù)溶可以使用生理鹽水。 穩(wěn)定性：有效期為6個(gè)月以上,實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對有效期進(jìn)行驗(yàn)證。,質(zhì)控物的選擇,質(zhì)控物數(shù)量、實(shí)驗(yàn)位置和頻次：質(zhì)控物數(shù)量應(yīng)滿足一個(gè)批號(hào)至少半年的實(shí)驗(yàn)量。每分析批至少安排一個(gè)弱陽性和一個(gè)陰性質(zhì)控(高值陽性血清只用于監(jiān)控“HOOK

12、效應(yīng)”)。檢測位置不能固定而應(yīng)隨機(jī)放置。 試劑盒所設(shè)的陰、陽性內(nèi)對照是用來計(jì)算CUT OFF值及有效性判斷標(biāo)準(zhǔn)，只能在同批號(hào)試劑內(nèi)使用，不能作為質(zhì)控指標(biāo)，質(zhì)控必須是可以監(jiān)控到不同批號(hào)試劑間的變化的外對照。,質(zhì)控物的選擇,陰性質(zhì)控品：特定項(xiàng)目人陰性血清混合物（若為ELISA質(zhì)控品濃度宜0.5倍臨界值左右） 陽性質(zhì)控品：特定項(xiàng)目人陽性血清混合物 ANA 1:1000 anti-dsDNA 1:100或以上 anti-ENA 中強(qiáng)度陽性：若組合式檢測，至少有2個(gè)項(xiàng)目為陽性,質(zhì)控物的選擇,弱陽性質(zhì)控品： ELISA：臨界值24倍的樣本 IIF:比臨界值高1個(gè)滴度。特定項(xiàng)目人陽性血清或陰陽性血清混合物。

13、 ANA ：1：1001:320 ，ANA熒光模型：均質(zhì)型，顆粒型，核仁型，或胞漿型等（可以每6個(gè)月變換，存儲(chǔ)質(zhì)控品至少有2個(gè)模型） anti-dsDNA：1:101:32 anti-ENA：低度陽性或臨界值24倍的樣本（若組合式檢測，至少有2個(gè)項(xiàng)目為弱陽性）,質(zhì)控物的選擇,1 收集陽性血清(無明顯溶血、黃疸、脂血及污染血清)到一定量（至少夠本室使用6個(gè)月以上）； 2 傳染性病原體需經(jīng)56、10小時(shí)滅活后使用； 3 0.2m生物濾膜過濾，去除纖維沉淀物和細(xì)菌； 4 稀釋：用正常人血清稀釋； 5 定值：與定值參考品進(jìn)行對比、求值，無參考品時(shí)選擇在2- 4倍Cut Off值附近的陽性值； 6 分裝

14、小瓶（每日用量），加蓋、貼簽，-20凍存?zhèn)溆茫?7 穩(wěn)定性及瓶間差評(píng)價(jià)。,自制質(zhì)控品,不同保存條件下： 2-8：CV值（滴度符合率）、累計(jì)CV值（符合率），穩(wěn)定期 -70：CV值、累計(jì)CV值，穩(wěn)定期 室溫：CV值、累計(jì)CV值，穩(wěn)定期 1）均一性評(píng)估：同批號(hào)質(zhì)控品隨機(jī)抽取5支（瓶），80%符合為合格。 2）穩(wěn)定性評(píng)估：評(píng)估1周，1月，3月，6月，1年。有效期一般可標(biāo)定為1年。,質(zhì)控品穩(wěn)定性的評(píng)價(jià),純定性試驗(yàn)：如免疫印跡、免疫金標(biāo)等，除膜條本身的內(nèi)對照外： 每檢測日或分析批，應(yīng)使用弱陽性和陰性質(zhì)控品兩個(gè)水平進(jìn)行質(zhì)控。 質(zhì)控判定規(guī)則 陰性質(zhì)控品的檢測結(jié)果為陰性 弱陽性質(zhì)控品的檢測結(jié)果為弱陽性,純定性

15、試驗(yàn)的質(zhì)控要求,如：抗ENA抗體譜檢測,以滴度或稀釋度判定的試驗(yàn)：如間接免疫熒光法、凝集試驗(yàn)等。 每檢測日或分析批，應(yīng)使用弱陽性和陰性質(zhì)控品兩個(gè)水平進(jìn)行質(zhì)控。 質(zhì)控判定規(guī)則： 陰性質(zhì)控結(jié)果為陰性 弱陽性質(zhì)控結(jié)果在靶值上下一個(gè)滴度或稀釋度,純定性試驗(yàn)的質(zhì)控要求,如：ANA、ANCA等,用數(shù)值判定結(jié)果的試驗(yàn)：如ELISA等。 濃度：弱陽性質(zhì)控品濃度宜在24倍臨界值左右，陰性質(zhì)控品濃度宜0.5倍臨界值左右（兩個(gè)水平）。 頻次：ELISA應(yīng)每板做質(zhì)控。 質(zhì)控判定規(guī)則：至少利用其多規(guī)則中一個(gè)偶然誤差及一個(gè)系統(tǒng)誤差規(guī)則。12s警告，13s和22s失控。,數(shù)值化定性試驗(yàn)的質(zhì)控要求,發(fā)現(xiàn)問題 分析問題產(chǎn)生的原

16、因 采取糾正措施加以改進(jìn)，進(jìn)而預(yù)防 驗(yàn)證和追蹤 避免同樣的問題出現(xiàn)第二次！,失控原因分析及處理,陽性質(zhì)控品失控的常見原因: 加樣不準(zhǔn)、溫育時(shí)間不穩(wěn)定、偶然誤差。 陰性質(zhì)控品的常見失控原因：污染、洗板不干凈、標(biāo)本間的交叉污染。 處理措施：一次性吸頭的使用，洗板機(jī)的維護(hù)，洗液的定期更換，溫育溫度和溫育時(shí)間的保證，加樣器及酶標(biāo)儀的校準(zhǔn)，熒光顯微鏡的維護(hù)等。,失控原因分析及處理,對沒有開展室間質(zhì)評(píng)的檢驗(yàn)項(xiàng)目，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)通過與其他至少2個(gè)以上實(shí)驗(yàn)室比對的方式判斷檢驗(yàn)結(jié)果的可接受性，并應(yīng)滿足如下要求： （a） 規(guī)定比對實(shí)驗(yàn)室的選擇原則； （b） 樣品數(shù)量：至少5份，包括陰性和陽性； （c） 頻率：至少每年2次； （d） 判定標(biāo)準(zhǔn)：應(yīng)有80%的結(jié)果符合要求； （e） 結(jié)果不一致時(shí)，應(yīng)分析不一致的原因，必要時(shí)，采取有效的糾正措