《熒光分光光度法》PPT課件.ppt

1、第六章 熒光分光光度法,基本要求： 了解熒光光譜法的基本原理和應用特點。了解熒光分光光度計的組成以及特點。掌握熒光光譜法的定量分析方法。了解影響熒光強度的因素。,第一節(jié) 概論,回顧：,四大類,一、應用：,1.定量分析 能產(chǎn)生熒光 或能形成熒光配合物的物質。 2.簡單定性 回答“是不是”。,二、特點：,靈敏度高，比吸收光譜法高10104倍。ppb 選擇性比吸收光譜法好。,第二節(jié) 基本原理,一、分子熒光的產(chǎn)生 物質吸收光輻射 價電子從基態(tài)躍到激發(fā)態(tài)，然后再回到基態(tài) 釋放能量以熱能的形式。以光輻射的形式。以光輻射形式釋放能量時，發(fā)射熒光。這種現(xiàn)象稱為光致發(fā)光。,最常見的光致發(fā)光：熒光和磷光。 兩者發(fā)

2、光機理不同，壽命不同。熒光壽命10-910-6秒，磷光壽命10-310秒。 熒光可由激發(fā)態(tài)的分子產(chǎn)生，也可由激發(fā)態(tài)的原子產(chǎn)生，本章介紹分子熒光。 由于熒光的產(chǎn)生由價電子引起，所以，熒光光譜屬于電子光譜，其波長范圍位于：紫外光區(qū)和可見光區(qū)。,二、激發(fā)光譜和發(fā)射光譜, 激發(fā)光譜 固定熒光波長，以激發(fā)光波長對熒光強度(F)所作的光譜曲線。, 發(fā)射光譜 固定激發(fā)光波長，以熒光波長對熒光強度F所作的光譜曲線。,三、分子熒光與分子結構的關系,分子要產(chǎn)生熒光，首先要能吸收紫外光或可見光。,能產(chǎn)生熒光的分子具有的結構特點：,【例】,芴具有剛性平面，產(chǎn)生的熒光比聯(lián)二苯強。,四、熒光強度與濃度的關系,：量子效率，

3、發(fā)射光量子與吸收光量子之比。 I0：入射光強度 ：摩爾吸光系數(shù) b： 光程 c：濃度,F=2.303I0bc,公式成立前提條件：bc=A0.05 即：當試樣濃度較低時（c0.05/b），C與F方成線性。（如果濃度過高，分子碰撞機會增大，而產(chǎn)生無輻射去激活，造成線性偏離。）,第三節(jié) 熒光分光光度計,一、基本結構示意圖,特點：1 光源方向與檢測方向成直角； 2 二個單色器。,二、主要部件及功能,1光源 高壓汞蒸氣燈，氙燈。 能提供紫外光和可見光，光強度比紫外-可見光分光光度計光源大得多。 2激發(fā)光單色器 作用：提供單波長的激發(fā)光。 色散元件：棱鏡或光柵。 出射狹縫寬度可調 。,3樣品池 須用石英材

4、料制成。 4熒光單色器 將樣品池中的散射光、反射光、雜質熒光等濾掉，只讓熒光通過。 出射狹縫寬度可調。 5檢測器 光電轉換元件，測定熒光的強度。 檢測方向與激發(fā)光方向垂直：在垂直方向上沒有透過光的干擾。 由于熒光的強度較弱，一般以光電倍增管作檢測器。,第四節(jié) 定量分析,一、定量方法 一般采用工作直線法。作CF直線。,配制一系列待測成分的標準溶液 C1 C2 C3 C4 C5 測出相應的熒光強度 F1 F2 F3 F4 F5 建立工作直線（ F C） 作圖法 回歸法 測量待測樣品，得F樣 從工作直線上找到待測成分的濃度C樣 由回歸方程計算出C樣,二、影響熒光強度測定的因素,1激發(fā)光照射 有一些熒

5、光物質若受到強光照射，會發(fā)生分解而導致F。 所以，熒光分光光度計通常在激發(fā)光單色器后裝配有光閘，在 測定時才打開光閘讓激發(fā)光照射樣品池。 2溫度 溫度，熒光效率下降，F(xiàn)。（因為，溫度，增加分子間 碰撞機會而使能量消耗掉。）,4溶劑 有些溶劑會使熒光效率下降，也可能帶來干擾熒光。,所以，有時需要pH緩沖液控制pH值在適當范圍內。,3pH值 pH值能改變某些熒光物質的電子構型從而影響熒光強度。,靈敏度高?？筛哌_ppb級（10-9），甚至ppt級（10-12）。 選擇性好，與能產(chǎn)生熒光的物質少有關。,三、定量分析的特點及應用,思考題,一、概念 （熒光）激發(fā)光譜 （熒光）發(fā)射光譜,二、問答題 試述分子熒光產(chǎn)生的過程。 試述分子熒光強度與濃度的關系式，并說明公式成立的前提條件及原因。 分別說明熒光分光光度計兩個單色器的作用，以及將光路設計成直角方向的原因。 為什么可見光分光光度計的光路是直線方向，而熒光分光光度計的光路是直角方向？,熒光分析的激發(fā)