實驗三 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)

1、實驗三：用聚丙烯酰胺凝膠電泳(聚丙烯酰胺凝膠電泳)分離血清蛋白，掌握盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的基本原理，學(xué)習(xí)盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作技術(shù)，了解盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的應(yīng)用。實驗?zāi)康模壕郾０纺z電泳采用不連續(xù)體系(即不連續(xù)的緩沖液組成、ph值和凝膠孔徑)，通過濃度效應(yīng)、分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)，可以根據(jù)血清中各蛋白質(zhì)組分的分子大小和電荷進行有效分離。實驗原理，由交聯(lián)單體聚丙烯酰胺(Acr)和亞甲基雙丙烯酰胺(Bis)形成的三維網(wǎng)狀凝膠。雙：交聯(lián)劑過硫酸銨：引發(fā)劑，提供自由基，引發(fā)聚合；四甲基乙二胺：催化劑，加速自由基的引發(fā)和釋放速度；聚丙烯酰胺凝膠聚合(PAG):1。濃縮效應(yīng)、分離機理：不連續(xù)

2、凝膠層孔徑：濃縮凝膠孔徑大，分離凝膠孔徑小，不連續(xù)酸堿度：電泳緩沖液酸堿度=濃縮膠酸堿度=6.7；分離凝膠酸堿度=8.9，緩沖離子不連續(xù)：甘氨酸-(慢離子)在電泳溶液中；凝膠中的氯離子；Pr-在它們之間，電位梯度是不連續(xù)的，有效遷移率=遷移率離解度。在電泳過程中，氯離子運行最快，留下一個低電導(dǎo)率區(qū)域，導(dǎo)致高電位梯度(電位與電導(dǎo)率成反比)，這使得甘氨酸離子趕上氯離子，蛋白質(zhì)被壓縮在它們之間。2.當(dāng)不同分子量或分子大小和形狀的蛋白質(zhì)通過一定孔徑的分離凝膠時，它們受到不同程度的阻斷，表現(xiàn)出不同的流動性。3、實驗儀器和試劑、電泳裝置、穩(wěn)定電源、圓盤電泳槽、毛細管滴管、刻度移液管、球瓶、玻璃管和膠帽、微

3、量移液管、注射器和長針、脫色搖床、TEMED-四甲基乙二胺，避光。過硫酸銨(新制備的)染色溶液：0.1溴酚藍溶液洗脫液：7乙酸其他試劑：參見下表中儲存溶液的制備。Acr和Bis:儲存在棕色瓶中，實驗步驟：1 .每人取一根電泳管，在膠帽中加入一滴40的蔗糖，塞住電泳管的底部，并塞緊。2.準備分離膠：(12片可裝膠)2毫升1號、2號和4毫升水，在球瓶內(nèi)混合均勻，用真空泵抽至無氣泡；加入8毫升3號，攪拌均勻，備用，最后加入，用毛細管滴管將膠倒入電泳管中，離管口2厘米處，然后沿玻璃管壁在離膠面約1厘米處緩慢加入3-5毫米高的水層，垂直放置，直到界面重新出現(xiàn)，表明凝膠已經(jīng)聚合。3。填充分離膠。配制濃膠：

4、 (可裝12片膠)4號1毫升，5號2毫升，6號4毫升，在球瓶中混合均勻，用真空泵抽出至無氣泡；加入1毫升3號，攪拌均勻備用，最后加入5。吸取上層分離膠的水分，將濃縮膠倒在高度約1.5厘米的分離膠上，然后沿管壁小心加入高度約0.5厘米的蒸餾水。垂直放置，直到凝膠化。糊化后，吸收上層覆蓋的水分；取下玻璃棒塞，吸出較低的蔗糖溶液。將電泳管放入橡膠塞中，放入電泳槽中，然后在下槽中加入緩沖溶液，以排出管底部的空氣。樣品制備：血清：1-2滴40%蔗糖：1滴0.05%溴酚藍：1滴，在EP管中混勻備用，將緩沖液倒入上罐中，蓋住玻璃管上端，排出管內(nèi)空氣，檢查有無泄漏。用微型取樣器吸取30微升樣品溶液，并將其涂在濃縮膠上。8。樣品裝載，9。電泳，上部槽的陰極；在下槽陽極，穩(wěn)定流量：1.5毫安/管，3分鐘，2.5毫安/管，約1小時，至玻璃管的3/4。10.剝離凝膠，電泳后取下玻璃管，用長針注射器吸取蒸餾水作為潤滑劑，將針頭插入玻璃管內(nèi)壁和凝膠柱表面之間，緩慢旋轉(zhuǎn)玻璃管，使針頭前進制膠時，徹底搖勻，最后加入促進劑TEMED。注意觀察實驗現(xiàn)象：界面、