激光掃描共聚焦顯微鏡.ppt

1、激光掃描共聚焦顯微鏡、概述、激光掃描共聚焦顯微鏡是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的劃時(shí)代的高新技術(shù)產(chǎn)品，在熒光顯微鏡圖像上安裝了激光掃描裝置，用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理，使光學(xué)圖像的分辨率提高30，用紫外或可見激光激勵(lì)熒光探針獲得細(xì)胞或組織內(nèi)部微結(jié)構(gòu)的熒光圖像，在亞細(xì)胞水平觀察如Ca 2、pH值、膜電位等生理信號(hào)和細(xì)胞形態(tài)的變化，成為形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、藥理學(xué)、遺傳學(xué)等領(lǐng)域下一代強(qiáng)有力的研究工具，是目前生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最先進(jìn)的熒光成像和細(xì)胞分析手段之一。 激光掃描共聚焦顯微鏡、laserscanningconfocalmicroscope、LSCM、共聚焦顯微鏡的基本知識(shí)、熒光和熒光顯微鏡，一般認(rèn)為

2、熒光的基本術(shù)語(yǔ)熒光物質(zhì)：某些物質(zhì)在特定波長(zhǎng)范圍的光線照射下，能發(fā)出波長(zhǎng)比照射光長(zhǎng)的光線熒光。 受激后能夠產(chǎn)生熒光的物質(zhì)稱為熒光物質(zhì)或熒光素激發(fā)光，能夠特異激發(fā)某熒光素的一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光線稱為該熒光素的激發(fā)光。 激發(fā)/吸收光譜吸收峰(最大吸收波長(zhǎng))、發(fā)射光3360的發(fā)射光譜發(fā)射峰(最大發(fā)射波長(zhǎng))熒光探針：能夠產(chǎn)生熒光的特異性生物染料(PI，Dapi )、標(biāo)記熒光素的特異性蛋白結(jié)合物(熒光抗體)自發(fā)熒光3360組織或細(xì)胞中的某些成分漂白：熒光物質(zhì)被激發(fā)后，發(fā)熒光的能力逐漸下降，最終漂白丟失。 二、熒光顯微鏡技術(shù)的基本原理、熒光顯微鏡、激發(fā)濾光器：從光源中分離出一定波長(zhǎng)范圍的激發(fā)光。 二向色鏡：反

3、射二向色鏡短波長(zhǎng)，透過長(zhǎng)波長(zhǎng)。另外，在以往的熒光顯微鏡中，來(lái)自水銀燈和氙燈的激發(fā)光照射視野的全部樣品容易受到軸向干涉和橫向干涉的影響，在一定厚度的樣品(大于2m )的物鏡的聚光平面的上下也激發(fā)光，焦點(diǎn)平面上的熒光像有一定的模糊，將其在軸向(所謂的樣品也受到在同一焦平面上附近激發(fā)的熒光的干涉，圖像對(duì)比度降低，稱之為橫(XY )干涉、模糊、熒光顯微鏡、共焦顯微鏡、共焦顯微鏡的優(yōu)勢(shì)，共焦顯微鏡很好地解決了傳統(tǒng)熒光顯微鏡的焦平面模糊問題，圖像的軸向和橫向干涉同時(shí)提供光切割能力，可將厚樣品三維切片(細(xì)胞CT )，與傳統(tǒng)的顯微鏡原理不同：傳統(tǒng)的顯微鏡一次照明視野中的樣品，可以用眼睛直接觀察或用CCD拍攝圖

4、像，但共焦點(diǎn)不是每個(gè)點(diǎn)的圖像， CCD無(wú)法獲取圖像，用軟件重構(gòu)圖像，共焦顯微鏡馬文史密斯提倡共焦顯微鏡的某種技術(shù)原理，1970年第一臺(tái)單光束共焦顯微鏡在20世紀(jì)80年代初發(fā)表了商品化的激光共焦顯微鏡(技術(shù)上不完善)，20世紀(jì)90年代后，成為完美的光學(xué)系統(tǒng)， 模塊化儀器設(shè)置修訂，靈活的軟件和高配置的計(jì)算機(jī)硬件，功能的擴(kuò)展和演進(jìn)，激光掃描共聚焦顯微鏡的發(fā)展從來(lái)不再是普通的光學(xué)顯微鏡，而是先進(jìn)的激光技術(shù)、顯微鏡技術(shù)、光度技術(shù)、計(jì)算機(jī)和圖像處理技術(shù)等許多高技術(shù)相結(jié)合是目前世界上最先進(jìn)的熒光成像和細(xì)胞分析手段之一，激光掃描共聚焦顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、倒立熒光顯微鏡激光掃描系統(tǒng)控制塔計(jì)算機(jī)和顯示器、

5、倒立熒光顯微鏡、倒立熒光顯微鏡Ar離子激光(458nm，488nm，514nm ) He-Ne綠色激光(543nm) He-Ne紅色激光(633nm )，1 )方向性好3360激光基本上是直線傳播2 )單色性好3360，掃描儀，針孔光欄：控制光學(xué)切片的厚度，排除非焦平面雜散光分色鏡使激發(fā)光到達(dá)樣本，使來(lái)自樣本的光線分離，然后進(jìn)入對(duì)應(yīng)的熒光檢測(cè)通道檢測(cè)器、系統(tǒng)控制塔、掃描頭進(jìn)行激光控制數(shù)據(jù)通信、激光、顯微鏡、掃描、共焦點(diǎn)、更清晰、三維成像等光源(單色光、點(diǎn)光源)、激光的工作方式、成像原理、光學(xué)切片、共焦點(diǎn)顯微鏡為高分辨率、人眼分辨率： 0.2 mm激光掃描共焦點(diǎn)顯微鏡的工作原理、 可以檢測(cè)出針孔

6、的光線條、檢測(cè)出的光線條、檢測(cè)出的光線條、檢測(cè)出的光線條、檢測(cè)出的光線條、檢測(cè)出的光線條、檢測(cè)出的光線條、檢測(cè)出的光線條、檢測(cè)出的光線條、檢測(cè)出的光線條、檢測(cè)出的光線條、檢測(cè)出的光線條、檢測(cè)出的光線條、檢測(cè)出的光線條圖A:激光通過照明針孔光欄形成點(diǎn)光源，通過物鏡聚光到樣品焦點(diǎn)面，只有從在焦點(diǎn)面上被激光掃描的點(diǎn)發(fā)出的一定波長(zhǎng)的熒光通過檢測(cè)針孔光欄到達(dá)檢測(cè)器，在顯示器上成像，相應(yīng)的熒光來(lái)自圖B:的非焦平面的光線都被檢測(cè)針孔光條遮擋，不能通過針孔光條到達(dá)檢測(cè)器，因此不能形成共焦圖像，、光源、光源、檢測(cè)器探頭處于相互對(duì)應(yīng)的共軛位置， 照明針孔和探針針孔有共同的焦點(diǎn)面，這是激光掃描共焦顯微鏡中“共焦點(diǎn)”

7、的真正含義a .增加掃描平面的分辨率b .點(diǎn)對(duì)點(diǎn)掃描，沒有雜散光的影響，激光共焦掃描系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，3 .細(xì)胞及1 .高分辨率、高靈敏度、高倍率2 .顯微鏡“CT”、三維重組、逐次掃描-激光的結(jié)構(gòu)，沿x軸逐次沿掃描行沿y軸重復(fù)掃描，焦點(diǎn)平面的各點(diǎn)的熒光圖構(gòu)成完整的“共焦點(diǎn)圖像”(光切片)， 平臺(tái)沿z軸上下移動(dòng)完成各層掃描的光學(xué)鏡圖像包括透射光圖像和反射光圖像，例如DIC圖像、明視場(chǎng)圖像等，光學(xué)鏡圖像主要用于輔助細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)的熒光定位、形態(tài)觀察、細(xì)胞計(jì)數(shù)等功能，圖像的特征如下由于使用低能激光對(duì)樣品的各個(gè)面進(jìn)行逐層掃描，因此不需要對(duì)檢查范圍(數(shù)百微米)內(nèi)的樣品進(jìn)行機(jī)械切割，能夠保持樣品的完整性、生物組

8、織和細(xì)胞的活性。收集雙熒光分解及合成圖像。 對(duì)于多熒光標(biāo)記的樣本可以捕獲各單色熒光獨(dú)立的共焦圖像、多熒光成本和圖像，并且利用順序掃描程序和光譜分析技術(shù)來(lái)克服各通道的光譜交叉干擾。 3、捕獲的熒光圖像質(zhì)量?jī)?yōu)于普通熒光顯微鏡，有利于觀察，具有高靈敏度光電倍增管、高靈敏度精確的掃描系統(tǒng)和光路設(shè)定糾正、先進(jìn)的圖像處理軟件，可增強(qiáng)或減弱樣品中的弱或強(qiáng)熒光信號(hào)，進(jìn)行去噪、平滑、提取等操作，實(shí)現(xiàn)圖像的在取得樣品共焦點(diǎn)圖像的過程中，能夠根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩?lái)選擇取得圖像的區(qū)域，確定CT式掃描的起點(diǎn)、終點(diǎn)、深度、步驟和切片的數(shù)量、最佳分辨率、圖像的倍率等，并測(cè)量各切片在樣品中的空間位置。 5三維重建圖像采集：利用先進(jìn)的

9、計(jì)算機(jī)軟件對(duì)CT掃描得到的各層連續(xù)光切片進(jìn)行三維重建，定量測(cè)量樣品三維結(jié)構(gòu)的直接觀察、空間定位、熒光強(qiáng)度和空間距離。 確認(rèn)熒光分子的定性和定位、定性地用特異熒光或特異熒光物標(biāo)記被測(cè)物本身后，用激光共聚焦顯微鏡采集圖像時(shí)，根據(jù)試樣中熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜、發(fā)光光譜等波長(zhǎng)特征，鑒別分離各被測(cè)物質(zhì)的特異熒光信號(hào)，在細(xì)胞原位分離分子的自身熒光或功能中常見的定位方法可以是利用單個(gè)熒光定位或者對(duì)于某些熒光分子其發(fā)出的單個(gè)熒光來(lái)確定樣本中的位置。 例如，蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞膜，可以通過使用不同的熒光探針標(biāo)記不同的成分來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述不同的熒光探針必須具有不同的光譜特性，包括不同的熒光發(fā)射波長(zhǎng)、發(fā)射光譜和激發(fā)光譜，以檢測(cè)

10、兩種或更多種不同的成分熒光和透射光的共定位雖然不是共焦圖像，但是可以提供許多有用的信息，可以觀察到樣本細(xì)胞的數(shù)量、位置分布和一些形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，這些透射光信息對(duì)于熒光定位非常重要，在熒光為點(diǎn)片狀分布的情況下，僅熒光信息不能定位，而與透射光重疊則可以看到熒光信號(hào)分布區(qū)域。 定量測(cè)定共焦點(diǎn)顯微鏡將收集到的共焦點(diǎn)圖像中的相關(guān)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為定量數(shù)據(jù)，即定量測(cè)定： 1圖像中的任意區(qū)域(或線)的熒光強(qiáng)度。 2熒光強(qiáng)度時(shí)間、空間及波長(zhǎng)的變化曲線和數(shù)據(jù)。 3圖像中的幾何殘奧儀表。 包括面積、厚度、空間距離、體積等。 定量測(cè)定、圖像中任意區(qū)域(或線)的熒光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度時(shí)間、空間及波長(zhǎng)的變化曲線和數(shù)據(jù)圖像內(nèi)的幾何殘奧計(jì)(

11、包括面積、厚度、空間距離、體積等)。 動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)是通過操作軟件控制設(shè)備，在一定時(shí)間內(nèi)以指定的時(shí)間間隔，自動(dòng)收集某一定視野的一系列圖像，取得樣品中的測(cè)定對(duì)象熒光信號(hào)的(強(qiáng)度、空間分布)動(dòng)態(tài)變化的定量結(jié)果，其測(cè)定結(jié)果是熒光強(qiáng)度隨時(shí)變化的曲線和數(shù)據(jù)、功能， 特點(diǎn)：實(shí)地監(jiān)測(cè)采用線掃描、平面掃描、連續(xù)斷層掃描等方式對(duì)樣品上的某些東西進(jìn)行連續(xù)收集，跟蹤樣品熒光強(qiáng)度和分布隨時(shí)間的變化選擇感興趣的區(qū)域，只動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)該區(qū)域，在某個(gè)時(shí)間段動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)圖像在一段時(shí)間內(nèi)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)圖像的常見應(yīng)用和方法是用激光掃描共聚焦顯微鏡在細(xì)胞原位檢測(cè)核酸激光掃描共聚焦顯微鏡，通過圖像顯示細(xì)胞內(nèi)核酸的分布特征和含量， 即實(shí)現(xiàn)定位的定性及定量檢

12、測(cè)核酸常用：細(xì)胞核定位及形態(tài)學(xué)觀察染色體觀察等前提：需要核酸用熒光探針標(biāo)記常用熒光探針： Hoechst33342 Hoechst33258 DAPI等均為DNA特異性熒光染料，細(xì)胞毒性小，特異性強(qiáng)，特異性與DNA結(jié)合， 與DNA結(jié)合后均用紫外光激發(fā)，發(fā)出明亮的藍(lán)色熒光，分辨率高，免疫熒光標(biāo)記技術(shù)、免疫熒光技術(shù)將抗體(或抗原)標(biāo)記為熒光素(如FITC )，與細(xì)胞或組織內(nèi)對(duì)應(yīng)抗原(或抗體)結(jié)合后，觀察、檢測(cè)、定性、定位及免疫熒光技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是免疫反應(yīng)的特異性，結(jié)合熒光檢查的敏感激光掃描共聚焦顯微鏡是定位和形態(tài)觀察免疫熒光樣品的最佳方法，在采集二維和三維圖像的基礎(chǔ)上，用單一或多重?zé)晒鈽?biāo)記的方法，可以

13、定位和同時(shí)定量分析所測(cè)定的少量抗原(半抗原)或抗體和細(xì)胞表面分子在細(xì)胞上的位置。由此，結(jié)合激光掃描共聚焦顯微鏡的定位精度和抗原抗體反應(yīng)的高度敏感性，可以得到定性、定位和定量的結(jié)果，多標(biāo)、單標(biāo)、DIC圖像染色體熒光染色、熒光蛋白檢測(cè)，GFP是多管水母屬的代謝產(chǎn)物，是水母熒光的來(lái)源，準(zhǔn)確定位和動(dòng)態(tài)觀察活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)成為跟蹤活組織或細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)和蛋白質(zhì)定位的標(biāo)志物的該蛋白質(zhì)吸收光波長(zhǎng)的最高峰為395nm，發(fā)光綠色熒光波長(zhǎng)的最高峰為509 mn，被紫外光或藍(lán)光激發(fā)時(shí)， 全部發(fā)出綠色熒光GFP，結(jié)合目標(biāo)基因可轉(zhuǎn)染細(xì)胞，可用激光掃描共聚焦顯微鏡等手段分析的目前使用的熒光蛋白包括藍(lán)色熒光蛋白(BFP )

14、、藍(lán)色熒光蛋白(CFP )和黃色熒光蛋白(YFP )、紅色其中BFP (藍(lán)色)位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，GFP (綠色)位于細(xì)胞核，YFP (黃色)位于細(xì)胞膜，RFP (紅色)位于線粒體。 圖ch5是4種熒光蛋白在細(xì)胞內(nèi)的共定位。 檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Annexin-V實(shí)驗(yàn)可以早、中、晚三期觀察細(xì)胞凋亡的早期，只有細(xì)胞膜上可見染成綠色的凋亡中期，Annexin一v熒光染料在細(xì)胞內(nèi)的PS (磷脂酰絲氨酸) Annexin一v一般與碘丙嗪(PI )結(jié)合使用，PI這種核酸染料不能透過完整的細(xì)胞膜，而在細(xì)胞凋亡末期的細(xì)胞和死細(xì)胞中，PI可以透過染紅。 因此，Annexin-v和碘丙嗪(PI )結(jié)合使用可以鑒別凋亡細(xì)胞和死細(xì)胞，初步確定凋亡的進(jìn)展，共聚焦顯微鏡可以分析Annexin-v共聚焦圖像的種類和實(shí)驗(yàn)結(jié)果， 第一通道是FITC的綠色熒光圖像第二通道是PI的紅色熒光圖像第三通道是細(xì)胞光學(xué)鏡圖像引起PS外翻的細(xì)胞與Annexin - V - FTTC結(jié)合，表達(dá)的綠色熒光圖像凋亡末期和死亡細(xì)胞通過PI染色紅顯示所有細(xì)胞的形態(tài)，位置和清楚地顯示了單綠、單紅、紅綠雙染細(xì)胞的位置。 確定凋亡細(xì)胞的進(jìn)展，1 .單染綠色細(xì)胞是凋亡早中期的細(xì)胞。 在細(xì)胞凋亡初期，只有細(xì)胞膜上染上綠色的細(xì)胞凋亡中期以后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜和細(xì)