第7章蛋白質(zhì)的分離純化和表征.ppt

1、Protein，第7章蛋白質(zhì)的分離純化和表征，蛋白質(zhì)含有酸/堿的AA殘基，兩性堿/酸越大pI越大，pI通常為6.0左右，一方面，在蛋白質(zhì)的兩性電離和等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)的分子量一般在1萬(wàn)到百萬(wàn)達(dá)爾頓之間的1達(dá)爾頓1C12 由化學(xué)組成測(cè)定最小分子量，1、測(cè)定蛋白質(zhì)中某微量元素的含量，2、假定蛋白質(zhì)中僅含有一個(gè)鐵原子的最低相對(duì)分子量=100* 55.8/鐵的含量，(SDSPAGE測(cè)定相對(duì)分子量，蛋白質(zhì)粒子電泳時(shí)的遷移率依賴于帶電荷遷移率與電荷和形狀無(wú)關(guān)，只依賴于相對(duì)分子質(zhì)量，巰基乙醇破壞了二硫化物鍵，(三)凝膠過(guò)濾法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量，凝膠化法只適合球狀蛋白分子的測(cè)定，三、蛋白質(zhì)的膠體性和蛋白質(zhì)的沉淀，(

2、一)膠體性(。 膠體溶液的特點(diǎn)：分子直徑在1-100 nm以內(nèi)溶于水難以凝聚沉淀的多數(shù)球狀蛋白質(zhì)可以形成穩(wěn)定的親水性膠體溶液，蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定因子：1.同種蛋白質(zhì)具有同種電荷，相互排斥2 .水膜彈性蛋白質(zhì)溶液具有丁達(dá)效應(yīng)， (2)蛋白質(zhì)沉淀Pr從膠體溶液中析出可逆沉淀：溫和的條件、溶液pH和Pr帶電的電荷Pr的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不發(fā)生變化、在適當(dāng)?shù)臈l件下進(jìn)行非改性沉淀pI沉淀法， 鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法等能夠再溶解的不可逆沉淀的強(qiáng)沉淀?xiàng)l件破壞Pr膠體溶液的穩(wěn)定性，不能再溶解Pr結(jié)構(gòu)和性質(zhì)沉淀的改性沉淀，例如加熱沉淀、強(qiáng)酸/堿沉淀、重金屬鹽和生物堿沉淀等，1 .鹽析法加入中性鹽除去蛋白質(zhì)的水合層，

3、鹽析一般不發(fā)生變性，等電點(diǎn)沉淀的蛋白質(zhì)溶液中加入NaCl使鹽溶解原因沉淀的鹽溶鹽析、鹽析、蛋白質(zhì)溶液中加入大量硫酸銨則蛋白質(zhì)析出的原因是，2 .降低有機(jī)溶劑沉淀脫水化層及介電常數(shù)，增加帶電質(zhì)點(diǎn)間的相互作用3 .等電點(diǎn)沉淀4 .形成重金屬鹽沉淀和帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)的不溶性鹽5 .生成生物堿試劑和一部分酸類沉淀和帶正電荷的蛋白質(zhì)的不溶性鹽6 .加熱改性沉淀天然結(jié)構(gòu)崩潰，疏水性基露出，破壞水化層和帶電狀態(tài)。 四、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則，總目標(biāo)：產(chǎn)品純度的增加或比活1 .預(yù)處理：因動(dòng)態(tài)/植物/細(xì)菌而異2 .粗分級(jí)分離：采用鹽析/等電點(diǎn)沉淀/有機(jī)溶劑分級(jí)分離等方法3 .細(xì)分級(jí)分離：凝膠過(guò)濾、離子交換色譜、吸附(1)分子大小不同的純化利用蛋白質(zhì)分子無(wú)法透過(guò)半透膜，將小分子物質(zhì)和半透膜用玻璃紙或纖維素材料、血液透析、小分子帶出，透析機(jī)、透析液、加壓、血液、2、密度梯度(區(qū)帶)。 (二)利用溶解度差的純化方法，1 .等電點(diǎn)沉淀調(diào)節(jié)溶液pH不同的蛋白質(zhì)在各自的pI下依次沉淀2 .鹽溶和鹽析，3 .有機(jī)溶劑分級(jí)分離法，降低介電常數(shù)爭(zhēng)奪水合膜，(三)電荷不同的分離方法的電泳，原理：蛋白質(zhì)在非等電點(diǎn)不帶電(4)