《植物細胞融合實驗》PPT課件.ppt

1、第六章 植物細胞融合（實驗）,一、細胞融合的目的和意義 細胞融合能實現(xiàn)遠緣雜交。其意義在于打破了僅僅依賴有性雜交重組基因創(chuàng)造新種的界限，有可能形成有性雜交方法無法獲得的新型雜種植物，廣泛組合各種基因型，擴大了遺傳物質(zhì)的重組范圍。,二、細胞融合（cell fusion)概念 在外力（誘導劑或促融合劑）作用下，兩個或兩個以上的異源細胞或原生質(zhì)體相互接觸，從而發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合并形成雜種細胞的現(xiàn)象。 通過細胞培養(yǎng)技術(shù)，這個細胞有可能發(fā)育成完整的生物個體，這個雜種后代有可能兼有兩個上代的一些優(yōu)良性狀。,細胞在融合過程中發(fā)生的主要變化： 呈致密狀態(tài)的體細胞在促融合劑的作用下，細胞膜的性質(zhì)發(fā)生變

2、化。 首先出現(xiàn)細胞凝集現(xiàn)象；然后部分凝集細胞之間的膜發(fā)生粘連；繼而融合形成多核細胞；在培養(yǎng)過程中多核細胞又進行核的融合而成為單核的雜種細胞，而那些不能形成單核的融合細胞在培養(yǎng)過程中逐漸死亡。,三、細胞融合技術(shù)原理和方法 由于體外培養(yǎng)的細胞很少會發(fā)生自發(fā)融合（融合頻率大約在10-410-6之間），因此要采用生物、化學或物理的方法人為地促使細胞融合。,促細胞融合的方法有：（一）病毒促進細胞融合 其中仙臺病毒（HVJ）是最早用于動物細胞融合的融合劑。（二）化學融合劑促進細胞融合 主要包括鹽類融合劑、聚乙二醇（PEG）、二甲亞砜（DMSO）、甘油-醋酸酯、油酸鹽、脂質(zhì)、Ca2+配合物等。 （三）電處理

3、融合法,聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG)融合 在眾多的化學試劑中，PEG應用最為廣泛，因PEG液比病毒更易制備和控制、活性穩(wěn)定、使用方便、而且促進細胞融合的能力更強。PEG是一種多聚化合物。,PEG誘導原生質(zhì)體融合的機理： 帶有大量負電荷的PEG與水之間的氫鍵結(jié)合，使溶液中自由水消失，由于高度脫水引起原生質(zhì)體凝集，形成大小程度不同的凝集物。原生質(zhì)體發(fā)生皺縮并大大扭曲變形，鄰近原生質(zhì)體之間緊密接觸。,在原生質(zhì)體細胞膜與膜緊密接觸的部位，膜內(nèi)蛋白質(zhì)顆粒易位并凝聚。接著可能是相鄰的剝?nèi)サ鞍踪|(zhì)的細胞膜間的類脂質(zhì)與類脂質(zhì)反應。繼之，類脂質(zhì)分子的擾動和重排導致接觸的細胞膜局部發(fā)生

4、融合，形成很小的細胞質(zhì)橋，之后它逐漸擴大，兩個原生質(zhì)體最終融合。,使用化學促融劑時，Ca2+是必需的。關于Ca2+的作用機理，有的認為是Ca2+和PO43-形成不溶于水的配合物，成為細胞間的鈣橋，由此引起融合。也有解釋為Ca2+結(jié)合到帶負電磷脂的電離基上，使磷脂分子在膜上相互分離，由此引起融合。,電融合（electrofusion technique)法： 電處理融合法是20世紀80年代發(fā)展起來的細胞融合技術(shù)，使融合率大為提高。,Electroporator 2510 from Brinkmann,Model ECM830 from BTX,電融合過程的分子機制： 是以電降解及雙向電泳的聯(lián)合作

5、用為基礎。通過電泳，兩細胞膜緊密接觸，且膜表面的蛋白質(zhì)分子分離，產(chǎn)生了無蛋白的類脂區(qū)。,電脈沖作用時引起膜結(jié)構(gòu)局部擾亂，出現(xiàn)小孔洞。而相對的脂雙層間分子在范德華力作用下，形成脂分子橋。由于連接處的細胞膜表面曲率大，處于高張力狀態(tài)，在熱力學上是不穩(wěn)定的，所以最終導致兩細胞逐漸融合成一個圓形的大球狀細胞。,A Alignment: Cells are brought into close contact by means of dielectrophoresis.,B Fusion pulse: A squarewave pulse of a mere 15 microseconds is app

6、lied in order to permeate the membrane. The membranes then fuse.,C Heterokaryon phase: The cell membranes are fused completely and the cytoplasm has mixed together. Only the nuclei remain separate.,D Entire fusion product: The nuclei are now fused as well. As a rule, the number of chromosomes is red

7、uced.,Fusion phases of oat protoplasts (Avena sativa),實際操作： 先把待融合的細胞或原生質(zhì)體混合，取樣置于100V/cm的高頻交流電場中，在非均勻交流電場中形成項鏈狀排列；,完整煙草原生質(zhì)體（40） 原生質(zhì)體成串（40）,再用15V/cm直流電脈沖/微秒沖擊細胞或原生質(zhì)體的粘接點，細胞膜降解造成若干微孔，于是在膜之間形成通道，使細胞質(zhì)得以交換；最后導致新的球狀細胞的形成。,電融合法優(yōu)點（與PEG法比較）：1、融合率高；2、重復性強；3、誘導僅發(fā)生在質(zhì)膜接觸部位，對細胞 或原生質(zhì)體傷害?。?、融合是在同步狀態(tài)下進行，活細胞數(shù)目多；5、裝置精巧

8、，方法簡單，可在顯微鏡下觀察或錄像融合過程；6、免去PEG誘導后的洗滌過程，誘導過程可控制性強。,Electrofusion,四、實驗材料、試劑和儀器1.材料 無菌煙草葉片、洋蔥根尖,2.試劑1）酶混合液 配制分兩部進行：（1）將CaCl2.2H2O 7 mmol/L NaH2PO4.2H2O 0.7mmol/L MES 3 mmol/L 甘露醇 0.5 mmol/L 用重蒸餾水溶解，調(diào)pH5.6，定容為酶儲備液，滅菌備用。,（2）使用時再加入： 纖維素酶 R-10 0.8% 果膠酶 R-10 1% 因酶制劑經(jīng)過高壓滅菌處理后會失活，故先將酶儲液滅菌，待用時再將酶制劑按比例加入到第一步已滅菌的

9、酶液內(nèi)。,2）配制CaCl2.2H2O 0.16mol/L （pH5.8-6.2 用于懸浮原生質(zhì)體） 3)PEG液： 30%（w/v) PEG(MW=6000) CaCl2.2H2O 0.01mol/L kH2PO4 0.00074mol/L 山梨醇 0.1 mol/L 調(diào)pH 5.8-6.2 ；用時現(xiàn)配！,4）電融合液： 甘露醇 0.6M CaCl2.2H2O 0.5mM pH 5.8,3.儀器 1）大型儀器： 高壓滅菌鍋，超凈工作臺，離心機，倒置顯微鏡，電融合儀。,2）一般實驗用品 大小培養(yǎng)皿，小燒杯，小滴管，刻度離心管，小漏斗，不銹鋼網(wǎng)300目,五.實驗步驟實驗路線：,煙草葉肉及洋蔥根尖

10、原生質(zhì)體酶解分離,提純原生質(zhì)體并調(diào)整原生質(zhì)體密度,a.調(diào)整融合儀參數(shù)，電擊使原生質(zhì)體融合 b.PEG法使原生質(zhì)體融合,倒置顯微鏡觀察并照相,實驗步驟： 1.取酶儲液10ml，分別加入纖維素酶和果膠酶0.08g,0.1g，制備酶液。 2.取材：煙草、洋蔥根尖各0.7g 取洋蔥根尖，并將其切成0.5cm長短大小放入小平皿中；取煙草葉片將其剪成0.5cm2 大小放入小平皿中。 3.酶解：將酶液等量加入到存有實驗材料的平皿中，放入250c培養(yǎng)箱酶解。洋蔥約4h，煙草約3h。,4.觀察酶解效果 5.原生質(zhì)體的分離和純化 1）酶解后，用300目銅網(wǎng)過濾酶液，去除未酶解的雜質(zhì)，將濾液收集在10ml離心管中。

11、 2）1000轉(zhuǎn)/分離心3分鐘，用吸管或移液槍棄上清（注意不要把收集的原生質(zhì)體吸走）。 3）用CaCl2.2H2O （約1ml）懸浮下面的原生質(zhì)體（PEG法）；電融合法則用電融合液懸浮。 4）顯微鏡觀察提純后的原生質(zhì)體，若雜質(zhì)較多可重復1）3）操作。,純化的原生質(zhì)體圖示,完整洋蔥原生質(zhì)體（40）,完整煙草原生質(zhì)體（40）,6.原生質(zhì)體的密度測定 用血細胞記數(shù)板記數(shù)。每一樣品測定3次，根據(jù)測定結(jié)果，將懸浮原生質(zhì)體密度調(diào)整至5*105個/ml。 7.原生質(zhì)體的融合 （一）PEG法 1）配制PEG液（5ml） 30%（w/v) PEG(MW=6000) 1.5 g CaCl2.2H2O 0.0074

12、g kH2PO4 0.0005 g 山梨醇 0.0911g 調(diào)pH 5.86.2,2）將兩種原生質(zhì)體懸液等量混合 3）用刻度吸管將混合的原生質(zhì)體懸液滴在直徑為60mm的平皿中，每皿78滴，每滴約0.1ml。然后靜置10分鐘，使原生質(zhì)體貼在皿底上，形成一薄層（應有35個平皿的重復）。 4）用吸管將等量的PEG溶液緩慢地加在原生質(zhì)體液滴上，再靜置1015分鐘。此時可取一個平皿在倒置顯微鏡上觀察原生質(zhì)體間的粘連。,PEG法原生質(zhì)體的融合圖示,1、煙草葉肉和洋蔥根尖細胞原生質(zhì)體融合（40）,2、煙草葉肉和洋蔥根尖細胞原生質(zhì)體的異源融合,（二）電融合法 1）融合儀參數(shù)設置： 成串電流頻率0.5MHz,電

13、壓30V,成串時間1min,融合脈沖幅寬40S,融合電壓150v,融合槽間距1mm 2）在融合小室中加入約100ul的原生質(zhì)體懸浮液，將融合小室接好電極后至于倒置顯微鏡下，靜置約3min，使懸浮的原生質(zhì)體沉降到平板底部，同時打開成串脈沖輸出開關及融合脈沖輸出開關，使高壓脈沖發(fā)生電路與融合小室接通。然后輕觸脈沖觸發(fā)開關，施加3次融合脈沖，每次間隔1s。融合脈沖后成串脈沖再保持1min。靜置融合小室2030min，在顯微鏡下觀察融合過程。,電融合法原生質(zhì)體的融合結(jié)果,原生質(zhì)體成串（40）,原生質(zhì)體融合（圖1）,電融合法原生質(zhì)體的融合結(jié)果,原生質(zhì)體融合（圖2）,原生質(zhì)體融合（圖3）,Overall

14、aims of research,To “capture” disease resistance from wild potato species To use segregating populations to identify plant disease resistance genes and transfer resistance into potato cultivars,SOMATIC HYBRIDIZATION IN SOLANUM,Somatic hybridization using protoplast fusion,Isolate protoplasts (typica

15、lly leaf mesophyll) from two parental lines Fuse protoplasts either chemically (PEG) or using electrofusion Cell membranes fuse forming one cell containing 2 nuclei On cell division nuclear material condenses together and hybrids cells are formed that contain DNA from both parental lines.,Potato pla

16、nts growing in a test tube,Freshly isolated potato protoplasts,Two protoplasts ready to fuse together,Fusion products begin to divide on nutrient medium,If the conditions are right, small shoots emerge from the green calli,Putative somatic hybrid plants,A fertile somatic hybrid,Phenotype of somatic

17、hybrids clearly shows characteristics of both parents,S. brevidens somatic hybrid S. tuberosum,Phenotype of intraspecific diploids of S. tuberosum,US-W9310.3 Somatic hybrid US-W9545.99,Somatic hybrids have ALL of the chromosomes from each parent plant,Verticillium wilt resistance test field at Hancock, Wisco