第8章(下)-分子生物學(xué)基本研究法.ppt

1、第六章 分子生物學(xué)研究法 （下）,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,2,本章主要內(nèi)容,基因表達(dá)研究技術(shù) 基因敲除技術(shù) 蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù) 基因芯片技術(shù) 其他分子生物學(xué)技術(shù),2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,3,是一種以測序為基礎(chǔ)定量分析基因組表達(dá)模式的技術(shù)，能夠直接讀出任何一種類型細(xì)胞或組織的基因表達(dá)信息。 SAGE的主要依據(jù): 1.一個910堿基的短核苷酸序列標(biāo)簽包含有足夠的信息，能夠唯一確認(rèn)一種轉(zhuǎn)錄物。 2.如果能將9堿基的標(biāo)簽集中于一個克隆中進(jìn)行測序，并將得到的短序列核苷酸順序以連續(xù)的數(shù)據(jù)形式輸入計算機中進(jìn)行處理，就能對數(shù)以千計的mRNA轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行分析。,6.1 基因表達(dá)

2、研究技術(shù),1、基因表達(dá)系列分析技術(shù)（SAGE） P193 （serial analysis of gene expression）,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,4,步驟： （1）選擇特定的限制內(nèi)切酶分離轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中這些代表基因特異性的9-10個堿基的核苷酸序列并制成標(biāo)簽。 （2）將這些標(biāo)簽連接在一起、克隆和測序。 （3）根據(jù)其占總標(biāo)簽的比例即可分析其對應(yīng)編碼基因的表達(dá)頻率。（圖P194） AE？TE？雙標(biāo)簽？如何分離3端酶切片段？,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,5,SAGE是基因表達(dá)定性和定量研究的一種有效工具，非常適合于比較不同發(fā)育狀態(tài)或疾病狀態(tài)的生物基因表達(dá)。 另外SAGE

3、能夠接近完整地獲得基因組表達(dá)信息，能夠直接讀出任何一種類型細(xì)胞或組織的基因表達(dá)信息。,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,6,2. RNA選擇性剪接,RNA選擇性剪接是指用不同的剪接方式（選擇不同的剪切位點組合）從一個mRNA前體產(chǎn)生不同的mRNA剪接異構(gòu)體的過程。 mRNA前體的選擇性剪接，使一個基因翻譯為多種蛋白質(zhì)序列，極大地增加了蛋白質(zhì)的多樣性和基因表達(dá)的復(fù)雜程度，是基因表達(dá)多樣性的重要表現(xiàn)形式。,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,7,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,8,3、原位雜交技術(shù)（in situ hybridization，ISH）,用標(biāo)記的核酸探針，經(jīng)放射自顯影（放

4、射性同位素，如3H、35S、32P）或非放射（如生物素、地高辛等）檢測體系（酶促免疫顯色），在組織、細(xì)胞、間期核及染色體上對核酸進(jìn)行定位和相對定量研究的一種手段。 原位雜交是分子雜交的一種，是在切片上進(jìn)行的，能顯微定位 。 可分為：RNA原位雜交和染色體原位雜交。,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,9,RNA原位雜交用放射性或非放射性（如地高辛 生物素等）標(biāo)記的特異性探針與被固定的組織 切片反應(yīng)，若細(xì)胞中存在與探針互補的mRNA分 子，兩者雜交產(chǎn)生雙鏈RNA，可通過放射性標(biāo)記 或經(jīng)酶促免疫顯色，對該基因的表達(dá)產(chǎn)物做出定 性定量分析。,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,10,熒光原位雜交

5、(FISH)： 對寡核苷酸探針做特殊的修飾和標(biāo)記，用原位雜交法與靶染色體或DNA上特定的序列結(jié)合，再通過與熒光素分子相耦聯(lián)的單克隆抗體來確定該DNA序列在染色體上的位置。 優(yōu)點：不需要放射性同位素，實驗周期短，檢測靈敏度高。,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,11,人肌糖原磷酸酶基因在11號染色體的定位結(jié)果。,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,12,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,13,4、基因定點突變（site-directed mutagenesis） 技術(shù) 通過改變基因特定位點核苷酸序列來改變所編碼的氨基酸序列。 常用于研究某個氨基酸殘基對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、催化活性以及結(jié)合配體

6、能力的影響，也可用于改造DNA調(diào)控元件特征序列、修飾表達(dá)載體、引入新的酶切位點等。,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,14,寡核苷酸介導(dǎo)的DNA突變技術(shù)（P198圖6-6） 以PCR為基礎(chǔ)：重疊延伸技術(shù)（P199圖6-7） 大引物誘變法（P200圖6-8） 以上三種方法雖不同，但原理都一致。,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,15,1、寡聚核苷酸介導(dǎo)的DNA突變技術(shù),已知序列的環(huán)狀DNA,人工合成一段引物,變性,模板,定點突變,細(xì)菌轉(zhuǎn)化,延伸誘變寡核苷酸引物,DNA聚合酶,篩選引入突變的環(huán)狀DNA,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,16,2、重疊延伸技術(shù),正向誘變引物FM,反向引物

7、 R2,正向引物 F2,反向誘變引物RM,已知序列DNA模板,在重疊區(qū)發(fā)生退火,PCR3,使用引物F2和R2擴增,PCR4,全長突變DNA片段,形成全長雙鏈突變DNA,反向互補,產(chǎn)物,產(chǎn)物,2,1,P C R,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,17,3、大引物誘變法,PCR1產(chǎn)物,正向誘變引物（M）,反向引物（R1）,雙鏈大引物,退火和野生型基因復(fù)性,PCR2,正向引物（F2）,退火溫度PCR2PCR1,已知序列DNA模板,全長突變DNA片段,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,18,PCR介導(dǎo)的基因定點突變方法的優(yōu)勢？ 1、突變體回收率高。 2、能用雙鏈DNA作為模板，可以在任何位 點

8、引入突變。 3、可在同一試管中完成所有反應(yīng)。 4、快速、簡便。,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,19,6.2 基因敲除技術(shù) P200 概念： 基因敲除技術(shù)（gene knockout)又稱基因打 靶（gene targeting）。這種技術(shù)是通過基因工程 的方法將一個結(jié)構(gòu)已知但功能未知的基因去除， 或用其他序列相近的基因取代（又稱基因敲 入），然后從整體上觀察實驗動物，從而推測相 應(yīng)基因的功能。這種人為地把實驗動物某一種有 功能的基因完全缺失的技術(shù)稱為基因敲除技術(shù)。,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,20,基因敲除技術(shù)分為： 完全基因敲除：用同源重組法完全消除細(xì)胞或者動植物個體中的靶

9、基因活性。 條件型基因敲除：用定位重組系統(tǒng)實現(xiàn)特定時間和空間的基因敲除。 同源重組：是指發(fā)生在非姐妹染色單體之間或 同一染色體上含有同源序列的DNA分子之間或 分子之內(nèi)的重新組合。,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,21,插入基因包括正向選擇標(biāo)記基因和負(fù)向選擇標(biāo)記基因。 正向選擇標(biāo)記基因neor(新霉素抗性基因)通常被插入到靶基因功能最關(guān)鍵的外顯子中，或通過同源重組置換靶基因最重要的功能域，以使靶基因徹底失活。 利用篩選培養(yǎng)基檢測是否存在正向選擇標(biāo)記基因，可以判定打靶載體是否整合到細(xì)胞的基因組中。,（1）完全基因敲除策略,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,22,負(fù)向選擇標(biāo)記基因HSV-

10、tk(皰疹病毒胸苷激酶基因)： 如打靶載體是隨機整合到細(xì)胞基因組上時，HSV-tk基因也被整合到基因組上，故細(xì)胞就不能在含有負(fù)篩選藥物(丙氧鳥苷)的培養(yǎng)基中存活。 皰疹病毒胸苷激酶蛋白可使無毒的丙氧鳥苷（GANC）轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘缘暮塑账?，而殺死?xì)胞，因而可用丙氧鳥苷篩選排除隨機整合的細(xì)胞株。 如打靶載體是通過同源重組整合到靶位點上， HSV-tk不能被整合到基因組中，細(xì)胞得以在含有正負(fù)篩選藥物的培養(yǎng)基中存活下來。（圖見P203）,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,23,圖6-10 正負(fù)篩選法（PNS法)篩選已發(fā)生同源重組的細(xì)胞,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,24,基本原理:,構(gòu)建與靶基

11、因同源 (1015kb)的載體,外顯子插有新霉素抗性基因 （neor）作為正選擇的標(biāo)志,皰疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因作為負(fù)選擇,體外培養(yǎng),新霉素(G418)和致死核苷類似物(GANC)作雙重篩選,將重組體導(dǎo)入ES細(xì)胞,存活的ES細(xì)胞,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,25,真核生物基因敲除的技術(shù)路線主要包括構(gòu)建重 組基因載體，用電穿孔、顯微注射等方法把重組 DNA導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞純系中，使外源DNA與胚胎干 細(xì)胞基因組中相應(yīng)部分發(fā)生同源重組，將重組載 體中的DNA序列整合到內(nèi)源基因組中并得以表達(dá)。,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,26,方法,表型分析,構(gòu)建載體,同源重組,篩選X

12、被敲除的ES細(xì)胞,顯微注射,回交得到X被敲除的動物,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,27,顯微注射命中率較高，技術(shù)難度相對大些。電穿孔法命中率比顯微注射低，操作使用方便。 胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）分離和體外培養(yǎng)的成功奠定了哺乳動物基因敲除的技術(shù)基礎(chǔ)。,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,28,(2)條件型基因敲除,條件型基因剔除是指某一特定細(xì)胞類型或細(xì)胞發(fā)育的特定階段剔除某一特定基因的技術(shù)。,常用的條件型基因敲除有： 噬菌體的Cre/LoxP系統(tǒng)、Gin/Gix系統(tǒng) 酵母細(xì)胞的FLP/FRT系統(tǒng)、R/RS系統(tǒng),2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,29,Cre重組酶：能介導(dǎo)兩個含34bp

13、的LoxP位點之間的特異性重組，使LoxP位點間序列或基因被刪除。 LoxP位點：是由兩個13bp反向重復(fù)序列和中間間隔的8bp序列共同組成，13bp反向重復(fù)序列是Cre酶的結(jié)合域。 首先通過同源重組把正向選擇標(biāo)記基因neo置于靶基因的內(nèi)含子中，并在靶基因重要功能域兩側(cè)內(nèi)含子中插入同向的LoxP位點。 （圖見P202）,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,30,構(gòu)建打靶載體,同源重組,篩選中靶ES,顯微注射,雜交刪除neor基因,特定階段誘導(dǎo)Cre酶 切除目的片段,動物觀察分析,Cre-loxP 重組系統(tǒng)進(jìn)行條件性基因剔除的程序：,體外培養(yǎng),2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,31,需消除

14、靶基因活性時： 通過與帶有重組酶基因ES細(xì)胞雜交，可以把兩個LoxP位點中間的DNA片段切除，使靶基因失活。 將標(biāo)記基因的兩側(cè)也連入LoxP序列可在它影響靶基因轉(zhuǎn)錄時，將其刪除。 從理論上說，可根據(jù)實驗需要，設(shè)計在不同發(fā)育時期、不同空間任意敲除任何一個靶基因。,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,32,T-DNA：是農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時，從Ti質(zhì)粒上切割下來轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的一段DNA。 Ti質(zhì)粒：是根癌農(nóng)桿菌染色體外的物質(zhì)，為雙股共價閉合的環(huán)狀DNA分子。 報告基因：是一種編碼可被檢測的蛋白或酶的基因，是一個表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。,（3）植物基因敲除技術(shù),利用農(nóng)桿菌T-DNA介導(dǎo)轉(zhuǎn)化

15、，將一段帶有報告基因的DNA序列整合到基因組DNA上，如插入目的基因內(nèi)部或附近，就會影響基因的表達(dá)，從而使基因失活。,基因敲除的意義： 研究基因功能 轉(zhuǎn)基因動物的制備 轉(zhuǎn)基因動物可作為“生物反應(yīng)器”生產(chǎn)藥物,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,34,6.3 蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù) 1、酵母雙雜交系統(tǒng)（yeast two-hybrid system） 蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用是很多生命現(xiàn)象的基礎(chǔ). 酵母雙雜交(yeast two hybrid) 技術(shù)是利用酵母遺傳學(xué)方法分析蛋白質(zhì)之間的相互作用，該方法建立以來，經(jīng)過不斷的完善和發(fā)展，不但可以檢測已知蛋白質(zhì)之間的相互作用，更重要的在于發(fā)現(xiàn)新的

16、與已知蛋白相互作用的未知蛋白。,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,35,酵母雙雜交由Fields在1989 年提出。其產(chǎn)生是基于對真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子特別是酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4性質(zhì)的研究。 GAL4包括兩個彼此分離的但功能必需的結(jié)構(gòu)域. 位于N 端1-174 位氨基酸殘基區(qū)段的DNA 結(jié)合域(DNA binding domain，BD)和位于C 端768-881位氨基酸殘基區(qū)段的轉(zhuǎn)錄激活域(Activation domain,AD)。,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,36,BD和AD單獨分別作用并不能激活轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，但 是當(dāng)二者在空間上充分接近時，則呈現(xiàn)完整的 GAL4轉(zhuǎn)錄因子活性并可激活

17、啟動子,使啟動子下 游基因得到轉(zhuǎn)錄.,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,37,Fields 建立了一個雙雜交系統(tǒng)，DB與X蛋白融 合，AD與Y蛋白融合，如果X、Y之間形成蛋白- 蛋白復(fù)合物，使GAL4 兩個結(jié)構(gòu)域重新構(gòu)成，啟 動特異基因序列的轉(zhuǎn)錄。 一般地，將DB-X 的融合蛋白稱作誘餌(bait),X 往往是已知蛋白，AD-Y 稱作獵物(prey),能顯示 誘餌和獵物相互作用的基因稱報告基因,通過對 報告基因的檢測，反過來可判斷誘餌和獵物之間 是否存在相互作用。,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,38,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,39,酵母雙雜交技術(shù)的基本原理,已知蛋白編碼

18、基因X,編碼BD基因,cDNA不同片段Y,編碼AD基因,誘餌基因,獵物基因,轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞,報告基因,表達(dá),不表達(dá),X與Y編碼蛋白有無相互作用,有,無,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,40,正向選擇基因neo的作用機理？ 通常被插入到靶基因功能最關(guān)鍵的外顯子中， 或通過同源重組置換靶基因最重要的功能域，以 使靶基因徹底失活。 利用篩選培養(yǎng)基檢測是否存在選擇標(biāo)記基因， 可以判定打靶載體是否整合到細(xì)胞的基因組中。 Cre重組酶的作用？ 能介導(dǎo)兩個34bp的LoxP位點之間的特異性 重組，使LoxP位點間序列或基因被刪除。,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,41,LoxP位點？ 是由兩個13

19、bp反向重復(fù)序列和中間間隔的8bp 序列共同組成。 13bp反向重復(fù)序列是Cre酶的結(jié) 合域。 Ti質(zhì)粒？ 是根癌農(nóng)桿菌染色體外的物質(zhì)，為雙股共價 閉合的環(huán)狀DNA分子。 報告基因？ 是一種編碼可被檢測的蛋白或酶的基因，是 一個表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,42,酵母雙雜交技術(shù)的意義？ 酵母雙雜交是利用酵母遺傳學(xué)方法分析蛋白質(zhì)之間的相互作用，該方法建立以來，經(jīng)過不斷的完善和發(fā)展，不但可以檢測已知蛋白質(zhì)之間的相互作用，更重要的在于發(fā)現(xiàn)新的與已知蛋白相互作用的未知蛋白。,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,43,酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4的結(jié)構(gòu)？ GAL4包括兩

20、個彼此分離的但功能必需的結(jié)構(gòu)域。 位于N 端1-174 位氨基酸殘基區(qū)段的DNA 結(jié)合域(DNA binding domain，BD)和位于C 端768-881 位氨基酸殘基區(qū)段的轉(zhuǎn)錄激活域(Activation domain,AD) 。,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,44,2、酵母單雜交法（yeast one-hybrid） 酵母單雜交(yeast one hybrid)技術(shù)是體外分析 DNA與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用的一種方法。 特點：通過該方法可以識別穩(wěn)定結(jié)合于DNA上 的蛋白質(zhì) ，可在酵母細(xì)胞內(nèi)研究真核生物DNA 與蛋白之間的相互作用，并通過篩選DNA文庫直 接獲得與靶序列相互作用

21、蛋白的編碼基因。,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,45,酵母單雜交技術(shù)最早是1993年從酵母雙雜交技術(shù) 發(fā)展而來。 酵母雙雜交技術(shù)通過對報告基因的表型進(jìn)行檢測 以實現(xiàn)對蛋白質(zhì)間相互作用的研究。 酵母單雜交技術(shù)則通過對報告基因的表型檢測， 分析DNA與蛋白之間的相互作用，以研究真核細(xì) 胞內(nèi)的基因表達(dá)調(diào)控。,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,46,真核生物的轉(zhuǎn)錄起始需要轉(zhuǎn)錄因子的參與。 這些轉(zhuǎn)錄因子通常由一個DNA特異性結(jié)合功 能域和一個或多個與其他調(diào)控蛋白相互作用的激 活功能域組成，即DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA- binding domain, BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域 (activat

22、ion domain, AD). 用于酵母單雜交系統(tǒng)的酵母GAL4蛋白即 是一種典型的轉(zhuǎn)錄因子.,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,47,基本原理： 將特定的順式作用元件構(gòu)建到最基本啟動子的上游，把報告基因連接到基本啟動子下游； 將GAL4 的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（BD）置換為其它蛋白（待測轉(zhuǎn)錄因子），只要它能與順式作用元件相互作用，就照樣可以通過其轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（AD）激活RNA聚合酶，從而啟動對下游報告基因的轉(zhuǎn)錄。 可通過報告基因的表達(dá)將編碼待測轉(zhuǎn)錄因子的基因篩選出來. 圖P206 6-15,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,48,基本操作過程為:,cDNA與已知酵母轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（A

23、D）基因融合,導(dǎo)入酵母細(xì)胞,基因產(chǎn)物 （蛋白質(zhì)）,順式作用元件,激活Pmin啟動子,報告基因得到表達(dá),篩選陽性克隆,測序分析,cDNA替換了編碼結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD)蛋白基因,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,49,該技術(shù)的應(yīng)用特點？ 1.能篩選到與DNA 結(jié)合的蛋白質(zhì)。 2.可直接從基因文庫中得到編碼該蛋白質(zhì)的核苷 酸序列。 3.酵母屬真核細(xì)胞，通過酵母系統(tǒng)得到的結(jié)果比 其他體外技術(shù)獲得的結(jié)果更能體現(xiàn)真核細(xì)胞內(nèi)基 因表達(dá)調(diào)控的真實情況。,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,50,4.免疫共沉淀技術(shù),這是一通過抗體來特異性的識別候選蛋白質(zhì)的方法 將靶蛋白的抗體連接到固體基質(zhì)上，再將可能與抗體

24、發(fā)生相互作用的待篩選蛋白加入反應(yīng)體系中，用低離心力沉淀或微膜過濾法，在固體基質(zhì)和抗體的共同作用下將蛋白復(fù)合物沉淀到試管的底部或微膜上。,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,51,靶蛋白抗體,固體基質(zhì),待篩選蛋白,低離心力沉淀或微膜過濾,親和反應(yīng),反應(yīng)體系,靶蛋白抗體,待篩選蛋白,相互作用,沉淀得到待篩選蛋白,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,52,是利用雙鏈小片段RNA(siRNA)高效、特異性降解細(xì)胞內(nèi)源mRNA，從而阻斷體內(nèi)靶基因的表達(dá)，使細(xì)胞出現(xiàn)靶基因缺失的表型。,5.RNAi技術(shù)（RNA interference，RNA干涉） P213,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,53

25、,1998年，首次發(fā)現(xiàn)雙鏈RNA被攝入細(xì)胞后，可高效特異性抑制同源的靶基因表達(dá)。 非哺乳動物細(xì)胞：較長的雙鏈RNA可直接產(chǎn)生RNAi作用。 哺乳動物細(xì)胞：較長的dsRNA（double-stranded RNA, dsRNA）會導(dǎo)致非特異性基因沉默。只有大約21個核苷酸的siRNA才能有效引發(fā)特異性基因沉默。P213 圖6-24,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,54,RNAi作用機制,Dicer酶,雙鏈RNA,siRNA （21 25個核苷酸的小片段雙鏈RNA）,沉默復(fù)合體（RISC） 的形成,切割目的mRNA分子中與siRNA反義鏈互補的區(qū)域,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,55

26、,RNAi技術(shù)的應(yīng)用：,與傳統(tǒng)的同源重組基因敲除技術(shù)相比 高穩(wěn)定性 高效率 易于操作 可實現(xiàn)多種基因突變,RNAi技術(shù)主要應(yīng)用于基因功能研究或基因治療及藥物篩選。,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,56,6.4 基因芯片及數(shù)據(jù)分析,基因芯片技術(shù)是生物芯片的一種。 生物芯片是高密度固定在固相支持介質(zhì)（玻璃片/尼龍膜）上的生物信息分子（如寡核苷酸、基因片段、cDNA片段或多肽、蛋白質(zhì)）的微陣列。陣列中每個分子的序列及位置都是已知的。 基因芯片上固定的是核酸類物質(zhì)，主要用于DNA、RNA分析。,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,57,基因芯片（gene chip） :利用點樣機等機械裝 置，

27、在玻璃等支持物表面整齊地點上高密度的、 成千上萬個“點”，每個“點”含有可與一種基 因雜交的一條DNA探針。由于芯片上有序地排列 著DNA探針，因此也被稱為微陣列。,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,58,基因芯片是能同時監(jiān)測大量靶基因表達(dá)的 實驗手段，從而迅速準(zhǔn)確地在基因組水平上 闡述不同生物組織或細(xì)胞中各種轉(zhuǎn)錄本的變 化規(guī)律。,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,59,原理：在芯片上滴加樣品后，在合適的條件下， 樣品中含有的各種核酸片段就與相應(yīng)的探針雜交。 由于核酸片段上已標(biāo)記有熒光素，激發(fā)后產(chǎn)生的 熒光強度就與樣品中所含有的相應(yīng)核酸片段的量 成正比，也就代表該基因的表達(dá)量。經(jīng)激光共

28、聚 焦掃描儀等裝置掃描后，所獲得的信息經(jīng)專用軟 件分析處理，即可獲得成千上萬種基因的表達(dá)情 況。正因為這種特點，基因芯片技術(shù)已成為當(dāng)前 生命科學(xué)研究的熱點之一。,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,60,過程： （1）大規(guī)模PCR擴增獲得獨立cDNA插入片段 （2）用機械手將PCR產(chǎn)物點在玻璃板,變性,固定 （3）分別從不同器官或組織中分離mRNA，反轉(zhuǎn)錄 生成cDNA （4）分別用cy3（綠色）cy5（紅色）兩種熒光染 料標(biāo)記兩種cDNA （5）將標(biāo)記后的cDNA與點好的芯片進(jìn)行雜交 （6）激光掃描芯片雜交結(jié)果，計算機處理 （7）分析雜交數(shù)據(jù) P215 圖6-25,2020/8/5,分子生

29、物學(xué)-第5章,61,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,62,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,63,基因表達(dá)分析芯片 基因多態(tài)性分析芯片 疾病診斷芯片,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,64,6.5 利用酵母鑒定靶基因功能（自學(xué)） 6.6 其他分子生物學(xué)技術(shù),2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,65,1. 凝膠阻滯試驗(EMSA),凝膠阻滯試驗（EMSA)是體外分析DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。是分離純化特定DNA結(jié)合蛋白的經(jīng)典方法。,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,66,原理： 在凝膠電泳中DNA朝正極移動的距離與其相對分子質(zhì)量的對數(shù)成正比，因此，沒有結(jié)

30、合蛋白質(zhì)的DNA片段跑得很快，而與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物的DNA由于受到阻滯而跑得慢。 當(dāng)特定DNA片段與細(xì)胞提取物混合后，若復(fù)合物在凝膠電泳中的遷移率小，就說明該DNA可能與提取物中某個蛋白質(zhì)分子發(fā)生了相互作用。,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,67,步驟：標(biāo)記待檢測DNA片段-與細(xì)胞提取物溫育-電泳-放射自顯影技術(shù)顯示條帶位置 用來研究與蛋白質(zhì)相結(jié)合的DNA序列的特異性。以及探針分子中與蛋白質(zhì)直接發(fā)生作用的關(guān)鍵性堿基。,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,68,方法：,同位素標(biāo)記待測的DNA片段,細(xì)胞提取物,DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物,探針DNA,溫育,PAGE電泳,放射自顯影,進(jìn)行DNA凝膠

31、分析,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,69,2.噬菌體展示技術(shù),噬菌體表面展示技術(shù)(Phage Display Technology)是一種研究蛋白質(zhì)相互作用的方法。根據(jù)蛋白質(zhì)還可以得到相應(yīng)的基因片段。,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,70,感興趣的蛋白質(zhì)基因,噬菌體表面蛋白基因,插入到噬菌體載體上,分離出噬菌體,插入,感染大腸桿菌,捕獲靶蛋白,基因表達(dá)蛋白質(zhì)展示在噬菌體表面上,侵染大腸桿菌,篩選噬菌體,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,71,3.蛋白質(zhì)磷酸化分析,由蛋白質(zhì)激酶和蛋白磷酸酯酶所催化的蛋白質(zhì)可逆磷酸化過程，是生物體內(nèi)一種普遍且重要的調(diào)節(jié)方式，控制著眾多的生理生化反

32、應(yīng)和生物學(xué)過程。細(xì)胞生長發(fā)育、形態(tài)建成、細(xì)胞周期調(diào)控、基因表達(dá)、蛋白合成以及神經(jīng)功能、肌肉收縮等都與磷酸化有關(guān)。,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,72,研究目的：底物蛋白磷酸化和蛋白激酶活性檢測。 蛋白激酶活性分析步驟（篩選激酶特異性底物） （1）獲取底物蛋白和待檢測蛋白激酶（組織提??；原核表達(dá)系統(tǒng)；真核表達(dá)系統(tǒng)） （2）進(jìn)行體外磷酸化反應(yīng) P227,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,73,蛋白激酶,底物蛋白發(fā)生磷酸化,蛋白質(zhì)磷酸酯酶,底物蛋白發(fā)生去磷酸化,ATP或GTP,磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到底物蛋白,磷酸化與去磷酸化,2020/8/5,分子生物學(xué)-第5章,74,蛋白質(zhì)磷酸化研究方法（電泳法）,底物蛋白,待檢測的蛋白激酶上樣,電泳,聚合到,SDS-聚丙烯酰胺凝膠,凝膠洗去SDS使蛋白質(zhì)復(fù)