3.3 紫外-可見分光光度計 (1)

1、第三節(jié)：紫外可見分光光度校正、第一部分紫外可見吸收分光法的原理第二部分紫外可見分光光度校正的結構和類型第三部分紫外可見分光光度校正的應用第四部分紫外可見吸收分光分析的條件和影響因素第五部分機器的使用操作、維護、第一部分紫外可見吸收分光法的原理、第一部分紫外吸收光譜紫外可見吸收光譜分析紫外可見區(qū)域為(1)10-200nm； 遠紫外光區(qū)域(2)200-400nm； 近紫外光區(qū)域(3)400-800nm； 可見光區(qū)域、可見光：混合光是以適當?shù)膹姸缺壤旌狭瞬ㄩL400760nm的電磁波的光，人們能夠視覺上看到，因此被稱為可見光。 紫外光：電磁波的波長小于400nm。 紅外光：電磁波的波長大于760nm

2、。 吸光光度法的基本理論，1，光譜的分類，單色光：具有同一波長的光稱為單色光。 復合光：包含多個波長的光稱為復合光。 互補光：適當顏色的2種光以一定的強度比率混合就能合成白色光，這2種顏色的光稱為互補色。 2、一些光的性質3、紫外可見分光光度法的概念、紫外可見分光光度法是基于物質分子對200760nm區(qū)域的光的選擇性吸收而建立的分析方法。 導入、問題：為什么不同的物質呈現(xiàn)不同的顏色是由于物質對光的選擇性吸收，溶液呈現(xiàn)被吸收物質的補色。 KMnO4水溶液呈紫紅色，K2Cr2O7水溶液呈橙色。 雖然多數(shù)物質的溶液本身為無色或淡色，但是它們和一部分的試劑發(fā)生反應，有色物質，例如Fe3和SCN-生成血

3、紅色絡合物。 Fe2與鄰二氮雜菲生成紅色配合物。如果將兩種適當顏色的光以一定強度比例混合以獲得白光，則這兩種光是互補光，其顏色是互補色。 4、互補光和補色，5、溶液有選擇地吸收光，溶液呈現(xiàn)不同的顏色是因為該溶液有選擇地吸收光。 入射光(白色光)全部透過溶液后，溶液變?yōu)闊o色透明。 入射光(白色光)全部被溶液吸收后，溶液變成黑色。 當入射光(白光)通過KMnO4溶液時，該溶液選擇性地吸收綠色波長的光，而其他顏色的光與白光互補地通過兩者，只保留紫紅色，不互補，所以KMnO4呈紫色。 例如，K2CrO4吸收藍色光，溶液黃色CuSO4吸收黃色光，呈現(xiàn)藍色。 物質結構不同轉變時的吸收和輻射能量不同對應的波

4、長不同，問題：為什么不同的物體有選擇地吸收光，結論：物體的顏色是物體對光的選擇性吸收的結果。 其顏色是物體吸收某種光的互補光的顏色。 是透射光的顏色。 帶有平行波長的單色光通過均勻的有色溶液時，光的一部分在容器表面反射，一部分被溶液吸收，一部分透過溶液。 如圖所示，通過測定、6、溶液對光的行為、吸收、能量守恒規(guī)則： I0=Ia Ir It、It的大小，求出吸收的光強度Ia、It，吸收越少光透過越強。 I0入射光的強度Ia吸收的光的強度Ir反射光的強度It透射光的強度，由于T=ItI0、T1，所以常用透射率，即T%=T100%、透射光度、吸光度、a=lg1/t，二、光的吸收法則朗伯維爾法則是，如

5、果溶液濃度一定，則入射光被溶液吸收AL在單色光的條件下液晶層的厚度不變，入射光被溶液吸收的量與溶液濃度成比例。AC、二、光吸收定律蘭伯特維爾定律表明，平行單色光通過均勻、非散射性稀溶液時，溶液對光的吸收程度與溶液濃度和液層厚度的乘積成比例，該公式是分光光度法定量分析的依據(jù)。 物理意義：朗伯維爾定律公式： A=KCL、二、光吸收定律朗伯維爾定律、注意事項、A=KCL、朗伯維爾定律不僅適用于有色溶液，也適用于其他均勻、不均勻的吸收物質(包括)，該定律適用于單色光，適用于可見光、紅外光和紫外光作為各種吸光光度法的定量依據(jù)的吸光度具有相加性是指溶液的總吸光度等于各吸光物質的吸光度之和。 吸光度、透光度

6、及濃度的關系：摩爾吸光系數(shù)k的研究，吸收物質的一定波長和溶劑條件下的特征常數(shù)可以作為定性鑒定的殘奧計，不隨濃度c和光路長度b的變化而變化。 溫度和波長等條件一定時，k只與吸收物質自身的性質有關，與被測定物濃度無關，同一吸收物質在不同波長的k值不同。 最大吸收波長max下的摩爾吸光系數(shù)通常用kmax表示。 kmax顯示了該吸收物質的最大吸光能力，也反映了光度法對該物質可達到的最大靈敏度的測定。 kmax越大表示該物質的吸光能力越強，用光度法測定的靈敏度越高。 k與濃度為1mol/L、液層厚為1cm時的某波長下的該溶液的吸光度在數(shù)值上相等。 用標準曲線法測定未知溶液的濃度，發(fā)現(xiàn)標準曲線經(jīng)常彎曲(特

7、別是溶液濃度高的情況)，這種現(xiàn)象被稱為與朗伯比耳定律的偏差。 引起這種偏差的因素(2種): 物理因素：機器的非理想引起入射光不是單色光化學因素。 僅適用濃度低于0.01mol/L的稀溶液，偏離朗伯啤酒法則的原因，朗伯啤酒法則的假設：所有吸光質點之間不發(fā)生相互作用的稀溶液(僅在c102mol/L的情況下吸光質點之間發(fā)生締合等相互作用，可能直接影響光的吸收因此，朗伯定律只適用于稀溶液。 溶液中存在解離、聚合、互變異構、配合物形成等化學平衡時。 改變吸光質點的濃度，影響吸光度。 吸收光譜曲線(定性分析)，使不同波長的光依次通過一定濃度和厚度的有色溶液，測定對各波長的光的吸收程度(用吸光度a表示)。

8、以波長為橫軸，吸光度為縱軸，繪制該物質的被稱為光吸收曲線(或吸收光譜曲線)的曲線。 結論： 1、溶液對不同波長光的吸收程度不同，最大吸收峰存在的位置稱為最大吸收波長max。 根據(jù)物質的不同，吸收曲線的形狀和最大吸收波長各不相同，可以利用吸收曲線作為物質定性分析的依據(jù)。 1-c (kmno4)=1. 5610-4 moll-1-c (kmno4)=3. 1210-4 moll-1-c (kmno4)=4. 6880，KMnO4光吸收曲線，結論： 1，在可見光區(qū)域內，KMnO4溶液對于波長525nm左右的綠色光3 .濃度不同時，其最大吸收波長不變，但濃度越大，吸收程度(光的吸光度)越大，吸收峰會越

9、高。 吸收曲線的作用：選擇測量波長進行定性分析判斷共存成分是否干擾測量，第二部分紫外可見分光光度校正的結構和類型，基本結構主要由光源、單色器、吸收池、檢測器和顯示器五部分組成。 另一方面，紫外可見分光光度校正的基本結構提供激發(fā)能量，使被測定分子產(chǎn)生吸收。 提供符合要求的入射光。 能夠提供足夠強的連續(xù)光譜是良好的穩(wěn)定性、長壽命，并且要求輻射能量不會隨波長而顯著變化。波長范圍應滿足分析需要，紫外波長200400nm為400760nm，1、光源、1、熱輻射光源用于可見光區(qū)，如鎢燈和碘鎢燈。 鎢燈的發(fā)光波長為3502500nm連續(xù)光譜。 最佳使用范圍為3201000nm。 2 .氣體放電光源氣體放電光

10、源用于氫燈和氘燈等紫外光區(qū)域。 發(fā)光波長160500nm的連續(xù)光譜。 最佳使用范圍為185375nm。 分類、入射狹縫：光源的光由此入射到單色儀的準直裝置：透鏡或復位鏡，使入射光成為平行光束的分散元件：將復合光分解為單色光的棱鏡或光柵； 聚光裝置：將分光后的單色光聚光到出射狹縫的透鏡或凹面反射鏡出射狹縫。 2 .光學系統(tǒng)，可將從光源發(fā)出的復合光分解成單色光，從中選擇任意波長的單色光。 作用：組成：單色儀的核心部分是分散元件，起到分光的作用。 分散元件主要由棱鏡和光柵棱鏡構成，有玻璃和石英兩種材料。 色散原理：不同波長的光通過棱鏡時具有不同折射率，分離不同波長的光。 光柵：利用光的衍射和干涉作用

11、制作的。 一系列等寬度、等距離的平行狹縫。 玻璃可以吸收紫外光，因此玻璃棱鏡只能在4001000nm的波長范圍內使用，只能在可見光區(qū)域使用。 石英棱鏡可以使用的波長范圍很廣，從1854000nm到紫外、可見、近紅外3個光領域都可以使用。 可用于紫外、可見及紅外光區(qū)域，在整個波長區(qū)域具有良好且大致均勻的分辨率。 優(yōu)點：具有色散波長范圍寬、分辨率高、成本低、容易保存、容易制造等優(yōu)點。 缺點：各級頻譜重疊，產(chǎn)生噪聲。 吸收池也稱為比色皿。 作用：放入被測量溶液，決定透光液層厚度的器件。 主要有石英吸收池和玻璃吸收池兩種。 石英吸收單元紫外區(qū)域一般采用350nm的玻璃吸收單元可見區(qū)域。 350nm，3

12、，吸收池，主要規(guī)格為0.5cm，1.0cm，2.0cm，3.0cm和5.0cm，如何鑒別：分別用紫外光測量，如有吸收則用玻璃比色盤，注意事項：用手執(zhí)行兩側的毛面，將放入液體高度四分之一的光學面含有腐蝕玻璃成分(例如F-、H3PO4等)的溶液不能長期放入比色盤中。 使用比色盤后請馬上沖洗干凈。 污垢洗不掉的話，用鹽酸乙醇(11 )溶液3mol/L浸漬，用水洗凈。 不要用火焰或電爐加熱或烤比色盤。 作用：利用光電效應，使透過吸收池的光信號成為可測量的電信號。 常用的檢測器是光電池、光電管和光電倍增管。 4、檢測器(光電轉換器)、光電倍增管、光電池、光電管、信號顯示器、使用檢流計或微傳感器的校正器數(shù)

13、字顯示和自動記錄型裝置、5、信號顯示系統(tǒng)、(1)設備使用波長：真空紫外分光光度校正(0.1-可見分光光度校正(350-700 nm ) 紫外可見分光光度修正(190-1100 nm )紫外可見紅外分光光度修正(190-2500 nm) (2)機器中使用的光學系統(tǒng)分類：單光束分光光度修正2光束分光光度修正2波長分光光度修正動力學分光光度修正、2、紫外可見分光光度修正的分類和特征、()單光束分光光度修正用單色器分光的平行光的束，參照溶液和樣品簡單便宜，適用于在某個波長下測量吸光度和透光度，一般不能進行全波段分光掃描，對光源和檢測器要求高的穩(wěn)定性。 (2)光束分光光度校正用單色儀進行分光后，用反射鏡

14、分解為強度相等的2束光，一束通過參照單元，另一束通過采樣單元。 光度校正能夠自動比較兩個光的強度，該比是樣品的透射率，由對數(shù)變換將其變換為吸光度，并記錄為波長的函數(shù)。自動記錄，高速全帶寬掃描。 可消除光源不穩(wěn)定、檢測器靈敏度變化等影響，特別適用于結構分析。 機器復雜，價格高。 M2、M3、島津UV-2450、() 2波長分光光度校正從同一光源發(fā)出的光分為2束，分別經(jīng)過2個單色器，利用能夠得到2個不同波長(1和2 )的單色光的折射器以一定的頻率交替通過相同的樣品單元，然后利用檢測器交替地通過不需要參照游泳池。 a是減去本底吸收后的吸光度。多組分混合物、混濁試樣(如生物組織液)分析，以及有本底干擾

15、或共存組分吸收干擾時，可以使用雙波長分光光度法，提高方法的靈敏度和選擇性。 可以通過雙波長分光光度修正得到導數(shù)光譜。 雙波長BECKMAN-DU_640，()動力學分光光度校正解決了光化學反應、輻射化學反應和酶催化反應中能量轉化、酶降解、生物合成等反應變化。 特點：測定時間判別、快速掃描、生化瞬間產(chǎn)物的吸收光譜和時變值。 (3)紫外可見分光光度修正的主要技術指標1 .波長范圍：表示機器可測定的波長范圍。 波長范圍越大，機器越好。 這個和機器使用的燈有關。 2 .波長精度：表示機器單色儀的波長誤差的程度。 波長誤差越小，設備的精度越高。 這和機器上使用的單色儀有關。 雜散光：表示單色光的純度。

16、這與生產(chǎn)單色儀的材料和加工工藝有關。 4 .光度測定精度：表示機器在每次測定時顯示讀取值的精度，即表示機器能夠正確讀取小數(shù)點后的位數(shù)。 位數(shù)越多，機器的精度越高。 這與機器使用的檢查系統(tǒng)有關。 5 .光度測定的再現(xiàn)性：每次的a讀取值的再現(xiàn)性與機器使用的檢測器的質量有關。 6 .分辨率指代設備標識吸收頻譜的微觀結構的能力，即指代設備可以對緊密相鄰的峰值所標識的最小波長間隔，這是測量設備性能的綜合指標。 第三部分紫外可見吸收光譜法的應用、一、定性分析通常根據(jù)吸收光譜的形狀、吸收峰的數(shù)量及與最大吸收波長的位置相對應的摩爾吸收系數(shù)進行定性鑒定。 一般采用比較光譜法：在相同的測定條件下，將被測物與已知標

17、準物的吸收光譜曲線進行比較，如果它們的吸收光譜曲線完全相同，可以認為是相同的物質。 在進行定性鑒定時，必須注意：1.測定溶劑：對標準物和被測定物必須具有良好的溶解度，其本身在測定的波長內不吸收光，具有良好的穩(wěn)定性。 2 .測試條件：標準物和被測物的測試條件必須完全相同。 例如溶劑、PH、離子強度、溫度及使用的機器等。 3 .改變測試條件：為了防止測試數(shù)據(jù)偽像，適當轉換現(xiàn)有條件，改變其中的某些測量條件，看標準物和被測物的吸收光譜是否完全相同。 二、結構分析判斷所含官能團、有機化合物的異構體。 (例如，如果某個化合物在250-300nm處有強吸收帶，則表示存在苯環(huán)的特征性吸收；如果在210-350nm處有強吸收帶，則可能含有兩個雙鍵的共軛單元。 三、純度鑒定由吸收光譜的