鏈霉菌操作手冊(cè)

1、鏈霉菌室實(shí)驗(yàn)操作手冊(cè)(2003年)第一章培養(yǎng)基抗生素生長(zhǎng)因子3常用抗生素及其使用濃度3lb (蘆薈伯坦)培養(yǎng)基3LA3基本培養(yǎng)基(MM)3R5(1L )鏈霉菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化使用4YEME (酵母糊麥芽糊培養(yǎng)基)1L (液體培養(yǎng)鏈球菌) 4TSBY (1L ) (液體培養(yǎng)鏈霉菌) 4MS培養(yǎng)基52CMY培養(yǎng)基(井岡的接合轉(zhuǎn)移用) 5YMS培養(yǎng)基(阿維，井岡產(chǎn)被孢霉) 5YD培養(yǎng)基5生長(zhǎng)因子補(bǔ)充物的使用濃度5第二章DNA基本操作7大腸桿菌質(zhì)粒的提取7酶聯(lián)反應(yīng)7DNA片段凝膠回收7DNA純化9E.coil總DNA的提取9鏈球菌質(zhì)粒DNA的少量提取(需要改良) 10去磷酸化處理(詳見(jiàn)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南及T

2、akara的CIAP使用說(shuō)明) 10AT克隆(詳見(jiàn)說(shuō)明書) 10超級(jí)藍(lán)牙11第三章PCR及相關(guān)技術(shù)13PCR13機(jī)動(dòng)戰(zhàn)士PCR重組(詳見(jiàn)PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南 p429重疊擴(kuò)展技術(shù)) 14PCR定點(diǎn)突變誘導(dǎo)(DpnI法) 14第四章基因片段轉(zhuǎn)移技術(shù)15大腸桿菌CaCl2法制備受體細(xì)胞及DNA轉(zhuǎn)化15DNA轉(zhuǎn)換器15大腸桿菌質(zhì)粒的快速檢測(cè)15接合轉(zhuǎn)移(詳見(jiàn)英文手冊(cè)第249頁(yè)) 16鏈霉菌原生質(zhì)體的制備16鏈霉菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化17PCR-Targeting技術(shù)中E.coli電轉(zhuǎn)換接受狀態(tài)的調(diào)制及電轉(zhuǎn)換17第五章RNA操作技術(shù)19鏈球菌總RNA的提取19鏈球菌的RT-PCR(promega RT kit

3、)19第六章蛋白質(zhì)基本操作技術(shù)21SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色21大腸菌可溶性蛋白的表達(dá)及提取(用于誘導(dǎo)IPTG的表達(dá)系統(tǒng)):21鏈球菌總蛋白提?。?22大腸桿菌靶蛋白的誘導(dǎo)及總蛋白檢測(cè)(包括BL21菌株中pET系列表達(dá)體系等T7表達(dá)體系):22western藍(lán)牙23第七章遺傳制圖相關(guān)技術(shù)25鏈球菌孢子懸浮液的制備25鏈球菌中NF的證明25孢子雜交25在遺傳圖像上的2個(gè)標(biāo)記基因之間定位新的基因25第八章其他技術(shù)27鏈球菌菌種保存27檢測(cè)鏈球菌淀粉酶活性27第一章培養(yǎng)基抗生素生長(zhǎng)因子常用抗生素及其使用濃度抗生素英語(yǔ)名稱和縮寫抗性基因儲(chǔ)藏液濃度(mg/ml )使用最終濃度(g/ml )鏈霉菌大

4、腸桿菌米高二厘米YEME洛杉磯或洛杉磯氨芐青霉素氯霉素潮霉素卡那霉素壯觀的霉菌霉素硫鏈霉素紅霉素阿殘奧霉素蘋果，蘋果色彩，CmlHygromycin、HygKanamycin，Km規(guī)格，SpcStreptomycin，StrThiostrepton，ThioErythomycin、EryAprAmycin、am美國(guó)職棒大聯(lián)盟電腦輔助設(shè)計(jì)哈伊格aac或aph阿達(dá)拉超時(shí)空要塞tsr艾瑞姆AAC三型潛艇10025 (無(wú)水乙醇合)5025505025(DMSO配置)10050r10102？5010510010r-2550502510-50r-50-2.5-5050-1002550505025不敏感20

5、30-50表示沒(méi)有記錄或者不能使用，儲(chǔ)存液除非特別說(shuō)明，否則用無(wú)菌水調(diào)制這張表僅供參考，不要用！ 不要！r表示不敏感由于km和Am具有交叉抵抗性，如果同時(shí)具有這兩種抵抗性基因，則應(yīng)適當(dāng)增加抗生素的量，并作對(duì)照。hyg容易看見(jiàn)光分解，被錫箔材料包裹著。有些抗生素在低鹽環(huán)境(如DNA培養(yǎng)基)如Hyg、Km和Vio中的篩選效率要求很高鋰離子培養(yǎng)基(Lu RIA-bertani )胰蛋白蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 5g、葡萄糖1g、向1000ml中加入蒸餾水，pH7.3左右(滅菌后初次使用時(shí)再次調(diào)整)洛杉磯在LB中加入最終濃度為1.52%的瓊脂粉(根據(jù)瓊脂的加入量，與青島瓊脂一樣約為1.5

6、%，華美時(shí)為2% )。藍(lán)白斑篩選時(shí)不加葡萄糖基本培養(yǎng)基溶液： L-海藻酸0.5g，K2HPO4 0.5g，MgSO47H2O 0.2g，以及，F(xiàn)eSO47H2O 0.01g克，蒸餾水最多1000ml毫升在裝有瓊脂2.5g的三角瓶500ml中分別注入溶液250ml進(jìn)行滅菌，使用時(shí)每瓶加入50%葡萄糖(8磅滅菌)5ml調(diào)整pH7.0。配置了MM的瓊脂為lab agar、Ice agar(IA )R5(1L )鏈霉親和素在原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化時(shí)使用103克蔗糖K2SO4 0.25g克MgCl26H2O 10.12g克10克葡萄糖Difco酪蛋白氨基酸0.1g微量元素溶液2mlOxoid酵母提取物5gTES

7、5.73g公司加蒸餾水至1000ml毫升將difco瓊脂5.5g裝入500ml的三角瓶中，加入上述溶液250ml，塞上塞子后滅菌8磅(114度15分種)。 使用時(shí)將培養(yǎng)基熔化，裝入每個(gè)瓶子KH2PO4(0.5%) 2.5ml毫升CaCl 22 h2o (5米) 1毫升脯氨酸(20%) 3.75ml毫升NaOH(1M )將pH值調(diào)整到7.3在營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株中加入適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)因子(參照手冊(cè) )。YEME (酵母糊麥芽糊培養(yǎng)基)1L (液體培養(yǎng)鏈球菌)Oxoid酵母提取物3goxo標(biāo)識(shí)蛋白蛋白蛋白5 g麥芽提取物(BD公司原Difco公司218630) 3g10克葡萄糖蔗糖* 340g克蒸餾水最多10

8、00ml高壓滅菌后放入： (8磅滅菌，113-114，15min，自動(dòng)滅菌鍋不能一次消滅很多東西，否則不能消滅。 中所述)MgCl 26 h2o (2. 5米) 2毫升/升在制備原生質(zhì)體時(shí)，再加入以下物質(zhì)甘氨酸(20%) * 25ml/L蔗糖的主要作用是維持鏈霉菌生長(zhǎng)時(shí)的滲透壓。甘氨酸阻礙鏈球菌細(xì)胞壁的形成，使菌絲片段更短，有利于溶菌，有利于外源DNA的導(dǎo)入。TSBY (1L ) (液體培養(yǎng)鏈霉菌)Oxoid胰蛋白酶湯粉(TSB) 30g蔗糖* 340g克Oxoid酵母提取物5g蒸餾水最多1000ml毫升不同菌株培養(yǎng)需要不同濃度的蔗糖，蔗糖的主要作用是維持鏈霉生長(zhǎng)時(shí)的滲透壓。微生物培養(yǎng)基蒸餾加

9、入水煮23小時(shí)的大豆餅粉，用紗布過(guò)濾得到濾液，每250ml濾液分注入5g瓊脂、5g甘露醇的500ml三角瓶中，滅菌10磅，使用時(shí)調(diào)pH7.2-7.3。2CMY培養(yǎng)基(井岡的接合轉(zhuǎn)移用)可溶性淀粉10g胰蛋白胨2g第一代航空母艦(NH4 )2SO4 2gK2 HPO4 1g克二氧化碳無(wú)機(jī)鹽溶液* 1 ml瓊脂20克蒸餾水1000 mlph值7.2無(wú)機(jī)鹽溶液(每升)FeSO4 .7H2 O 1gMgCl.6 H2 O 1gZnSO4. 7H2 O 1gYMS培養(yǎng)基(阿維、井岡產(chǎn)被孢霉)酵母提取物4g可溶性淀粉4g麥芽糖10gCoCl.6 H2 O 5mg毫克瓊脂20克蒸餾水1000 mlph值7.

10、2培養(yǎng)基酵母提取物4g麥芽糖10g葡萄糖4克二十八禁游戲CaCl 1.5g克瓊脂15克蒸餾水1000 mlph值7.2生長(zhǎng)因子補(bǔ)充物的使用濃度天藍(lán)色鏈霉菌1258、J1501等都是營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，培養(yǎng)這些菌株時(shí)需要在培養(yǎng)基中補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)因子，使用濃度如表所示生長(zhǎng)因子補(bǔ)充物的使用濃度表化合物儲(chǔ)存液(mg/ml)1最終作用濃度(g/ml )組氨酸(Histidine )1050其他氨基酸27.537腺嘌呤、鳥嘌呤胸腺嘧啶、尿嘧啶1.57.5維生素0.10.51 .儲(chǔ)藏液用無(wú)菌去離子水配置，滅菌8磅后用4oC保存。2 .對(duì)半胱氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，補(bǔ)充光氨酸。第二章DNA基本操作大腸桿菌質(zhì)粒的提取酚/氯仿

11、溶液萃取法1 .接種5ml LB，37搖床一晚培養(yǎng)(12小時(shí))2 .離心分離，3000rpm，去5min上清3 .振蕩混合沉淀，分注到2個(gè)離心管中，spin吸收上清，加入150l的溶液I (50mmol/L葡萄糖、25mmol/L TrisCl(PH8.0)、10mmol/leel4 .加入溶液ii (用0.2 mol/l NaOH、1%SDS、2倍的溶液現(xiàn)在配合) 300l后，振蕩均勻混合，處理2分鐘后，加入溶液III(5mol/L醋酸鉀60ml、冰醋酸11.5ml )加入酸性苯酚/氯仿溶液120l，振蕩攪拌，以12000rpm離心5min，提取上清液，放入新的離心管中。用120ul氯仿重復(fù)

12、操作5。7 .加入等體積的異丙醇或二倍體體積的乙醇，混合，以12000rpm離心7min。8 .沉淀用70%乙醇洗滌2次，每次洗滌10分鐘。 50干燥后，加入適量的無(wú)菌去離子水(ddH2O )溶解，在-20下保存。氯化鋰萃取法1 .前四份同苯酚/氯仿溶液萃取法(用Solution I II III處理)加入等體積的異丙醇，攪拌，使DNA沉淀，以12000rpm離心7min。 去上清，盡量去干凈。3 .用少量的70%乙醇洗滌(洗異丙醇)，離心分離盡醇，在50下干燥沉淀，用適量的ddH2O(100ul )充分溶解(可溶解在50度水浴中)，然后用4/5體積的氧化鋰溶液(濃度約10mol/L分鐘)4 .以12000rpm離心5min，去除上清，放入新的離心管中，用等體積的異丙醇混合，以12000rpm離心8min，去除上清。5 .沉淀物以70%乙醇洗滌2次，每10分鐘洗滌一次。 50干燥后，加入一定量的無(wú)菌去離子水(ddH2O )溶解，在-20下保存。酶鏈反應(yīng)一般采