微生物次級代謝產物生物 合成的調節(jié)機制.ppt

1、,4.4 微生物次級代謝產物生物 合成的調節(jié)機制,微生物的新陳代謝錯綜復雜，參與代謝的物質又多種多樣，即使是同一種物質也會有不同的代謝途徑，而且各種物質的代謝間存在著復雜的相互聯(lián)系和相互影響。 微生物體內的次級代謝和初級代謝一樣，都受菌體代謝的調節(jié).,微生物的代謝調節(jié)主要依靠兩個因素來實現(xiàn)，即調節(jié)參與代謝的有關酶的活性(激活或抑制)和酶量(誘導或阻遏)。,1 初級代謝對次級代謝的調節(jié),微生物的初級代謝對次級代謝具有調節(jié)作用。當初級代謝和次級代謝具有共同的合成途徑時，初級代謝的終產物過量，往往會抑制次級代謝的合成，這是因為這些終產物抑制了在次級代謝產物合成中重要的分叉中間體的合成。,如賴氨酸和青

2、霉素的生物合成過程中有共同中間體a氨基己二酸，當培養(yǎng)液中賴氨酸過量時，則抑制a氨基己二酸的合成，進而影響到青霉素的合成。,2 碳代謝物的調節(jié),一般情況下，凡是能被微生物快速利用、促進產生菌快速生長的碳源，對次級代謝產物生物合成都表現(xiàn)出抑制作用(表4-2)。 這種抑制作用并不是由于快速利用碳源直接作用的結果，而是由于其代謝過程中產生的中間產物引起的。,葡萄糖效應,阻遏作用是由于菌體在生長階段，速效碳源(如葡萄糖和檸檬酸等)的分解產物阻遏了次級代謝過程中酶系的合成，只有當這類碳源耗盡時，才能解除其對參與次級代謝的酶的阻遏，菌體才能轉入次級代謝產物的合成階段。,青霉素發(fā)酵中加入葡萄糖，有利于菌體生長

3、，卻抑制了青霉素的合成；而在培養(yǎng)基中加入乳糖，由于乳糖需要水解為葡萄糖和半乳糖，因此利用較為緩慢，對青霉素的合成沒有抑制作用。,放線菌素的生物合成過程中抗生鏈霉菌生物合成吩惡嗪酮合成的酶(PHS)受到碳分解產物的調控，高濃度的葡萄糖強烈地阻遏其合成，但卻不能阻遏經pPH24轉化的變青鏈霉菌中PHS的合成，這個事實提示從抗生鏈霉菌中克隆到的DNA片段帶有自己的啟動子，沒有產生葡萄糖效應的調節(jié)序列，或是在變青鏈霉菌中不存在參與調控的負調節(jié)蛋白。,常采用其他碳源,生物合成都受到葡萄糖的阻遏的許多次級代謝產物，如麥角生物堿、頭孢菌素C、螺旋霉素、紫色桿菌素、嘌呤霉素、吲哚霉素. 新生霉素合成，如果培養(yǎng)

4、基中檸檬酸和葡萄糖同時存在，菌體優(yōu)先利用檸檬酸，此時不合成新生霉素，只有當檸檬酸被耗竭和出現(xiàn)二次生長時，菌體才開始利用葡萄糖并合成新生霉素。,對大腸桿菌的碳代謝物阻遏實質的研究表明阻遏作用是葡萄糖通過細胞膜進入細胞時被磷酸化，在脫磷酸化的過程中磷酸轉移酶(PCT)系統(tǒng)滅活了腺苷酸環(huán)化酶，從而減少了細胞內的環(huán)腺苷酸(cAMP)的形成。外源加入cAMP可以解除阻遏作用。實驗還證明這種分解代謝產物的阻遏作用是發(fā)生在轉錄水平上的。,3 氮代謝物的調節(jié),蛋白質、黃豆餅粉等利用較慢的氮源，可以防止和減弱氮代謝物的阻遏作用，有利于次級代謝產物的合成； 無機氮或簡單的有機氮等容易利用的氮作為氮源(胺鹽、硝酸鹽

5、、某些氨基酸)時，能促進菌體的生長，卻不利于次級代謝產物的合成 .,谷氨酸和丙氨酸能阻遏參與放線菌素合成的犬尿氨酸甲酰胺酶的形成，抑制放線菌素的合成； 半胱氨酸和甲硫氨酸能阻遏參與鏈霉素生物合成的甘露糖苷鏈霉素合成酶的形成，影響鏈霉素的合成； 銨能阻遏參與B-內酰胺抗生素生物合成的三肽合成酶(ACV)和脫乙酰氧頭孢菌素C合成酶的形成，導致它們的合成受到抑制。,高濃度的NH4+和一些氨基酸阻遏利福霉素、放線菌素、氯霉素、白霉素和黃曲霉素等抗生素，這主要是因為NH4+與谷氨酰胺合成酶(GS)有關，濃度越高，GS活力越低，抗生素的合成能力也越低。,利福霉素的合成中，發(fā)現(xiàn)硝酸鹽能促進其生物合成，原因：

6、硝酸鹽的存在可以促進糖代謝和三羧酸循環(huán)酶系的活力以及琥珀酰CoA轉化為甲基丙二酰CoA的酶活力，從而為利福霉素的合成提供更多的前體；硝酸鹽可以抑制脂肪酸合成，使部分合成脂肪酸的前體乙酰CoA轉為合成利福霉素脂肪環(huán)的前體；硝酸鹽還能促進菌體GS的活力， 使GS濃度降低,同樣增加利福霉素前體的濃度。,4 磷酸鹽的調節(jié),過量磷酸鹽對四環(huán)類、氨基糖苷類和多烯類、大環(huán)內酯類等32種抗生素的生物合成產生阻抑作用。這些次級代謝產物的生物合成只有在適當?shù)牧姿猁}濃度下才能進行。 磷酸鹽濃度的高低還能調節(jié)次級代謝產物合成期出現(xiàn)的早晚，當磷酸鹽接近耗盡時，才開始進入次級代謝產物的合成期。磷酸鹽起始濃度高，耗盡時間長

7、，合成期就向后拖延。,磷酸鹽還能使處于非生長狀態(tài)的、產抗生素的菌體逆轉成生長狀態(tài)的、不產抗生素的菌體。,4.1 促進初級代謝、抑制次級代謝,磷酸鹽對初級代謝途徑中的許多酶(如磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)有刺激作用，因而促進初級代謝，并提供大量的初級代謝中間產物以滿足微生物快速生長對大分子生物合成的需要。初級代謝的加速，競爭了合成初級代謝產物和次級代謝產物共用的分叉中間體，從而抑制了次級代謝產物的合成。,4.2 抑制次級代謝產物前體的形成,磷酸鹽抑制參與次級代謝產物前體合成酶的活性，從而抑制次級代謝產物前體的形成，影響次級代謝產物的生物合成。 如合成聚酮體的前體丙二酰CoA，是由磷酸烯

8、醇式丙酮酸經羧化和脫羧而來的，磷酸鹽對磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶有抑制作用，從而減少前體丙二酰CoA的濃度，進而影響次級代謝產物的合成。,肌醇是鏈霉素合成的一個前體，它由6-磷酸-葡萄糖環(huán)化酶催化形成，而磷酸鹽能增加對環(huán)化酶有競爭性抑制作用的焦磷酸的合成，使得肌醇的合成受到抑制，抑制了鏈霉素的生物合成。 另外，過量的磷酸鹽抑制單磷酸己糖途徑，使碳代謝有利于糖酵解途徑。,許多抗生素的生物合成與單磷酸己糖途徑有關，如參與核苷類抗生素生物合成的核糖、芳香體結構抗生素的重要中間體莽草酸等，糖代謝途徑的改變，減少了這些前體物質的供應，從而抑制次級代謝產物的合成。,4.3 阻遏次級代謝產物合成中某些關鍵酶的合

9、成,次級代謝產物的生物合成是由一系列酶促反應完成的，磷酸鹽阻遏次級代謝產物合成過程中一些關鍵酶的合成，從而抑制次級代謝產物的形成。 在鏈霉素合成中，轉脒基酶和催化N脒基鏈霉胺磷酸化的鏈霉胺激酶都是鏈霉素生物合成的關鍵酶，這兩種酶的合成均受到磷酸鹽阻遏。,泰樂菌素結構中氨基糖合成中的一些關鍵酶，如脫水酶、氧化還原酶和轉甲基酶也都受到磷酸鹽阻遏。 合成殺念菌素的前體，即對氨基苯甲酸(PABA)是次級代謝所特有的酶(對氨基苯甲酸合成酶)以分枝酸為底物合成的，對氨基苯甲酸合成酶的形成受到磷酸鹽的強烈阻遏，它是在轉錄水平進行調控的，當磷酸鹽的濃度達到75 mmol/L時，對氨基苯甲酸合成酶的mRNA的合

10、成將下降95，10mmol/L的磷酸鹽就能完全抑制其合成。,4.4 抑制次級代謝產物合成中某些關鍵酶的活性,堿性磷酸酯酶是鏈霉素、紫霉素及萬古霉素等抗生素生物合成中的一個關鍵酶，它催化一些中間體的脫磷酸反應，過量的磷酸鹽抑制磷酸酯酶的活性。 磷酸酯酶的活性與鏈霉素的合成具有正相關性，如果培養(yǎng)基中磷酸鹽的濃度合適，菌體在生長期磷酸鹽將被利用，開始進入鏈霉素合成階段時，可以立刻觀察到堿性磷酸酯酶活力的增加。,在鏈霉素的生物合成中有幾步磷酸酯酶所催化的去磷酸化反應，過量的磷酸鹽能抑制這幾步的一個或多個磷酸酯酶的活性，因而抑制鏈霉素的合成。特別值得一提的是鏈霉素合成的最后一個中間體是鏈霉素磷酸酯，必須

11、經堿性磷酸酯酶的作用脫去磷酸根才能生成鏈霉素，過量的磷酸鹽抑制了該酶的活性，使該反應不能順利進行，導致無活性的鏈霉素磷酸酯的積累，抑制了具有抗菌活性的鏈霉素的合成。,4.5增加菌體能荷狀態(tài)，促進初級代謝,能荷 可按下式計算： EC()=(ATP+12ADP) (ATP+ADP+AMP)X100,通常情況下，高產的次級代謝產物產生菌株體內的ATP濃度比低產菌株低，細胞內ATP水平可以通過培養(yǎng)基中磷酸鹽的濃度來調節(jié)。如果在培養(yǎng)基中加入過量的磷酸鹽，可以大大提高菌體內ATP濃度，降低次級代謝產物的合成。,例如，在合成殺假絲菌素的灰色鏈霉菌培養(yǎng)液中添加5 mmol/L的磷酸鹽，產生菌對氧的需要量顯著增

12、加，細胞內ATP濃度增大，抗生素的合成立即停止，同時還伴有RNA、DNA和蛋白質的合成速率恢復到菌體生長期的速率水平，促進了初級代謝；當磷酸鹽被耗盡時，菌體的生長速率開始下降，抗生素的合成又重新開始。,在菌體迅速生長期，過量磷酸鹽存在，可以使次級代謝產物合成酶類不能形成，也可以抑制次級代謝產物合成酶的活性，說明磷酸鹽的調節(jié)是在轉錄水平上進行的。,5 ATP調節(jié),ATP直接影響次級代謝產物合成和糖代謝中某些酶的活性。 四環(huán)素的生物合成,磷酸烯醇式丙酮酸,乙酰CoA,乙酰CoA羧化酶,丙二酰CoA,菌體生長期占主導地位,磷酸烯醇式丙酮酸,羧化酶,草酰乙酸,羧基轉移酶,四環(huán)素合成期起決定作用,兩條途

13、徑,因此，強化第二條途徑有利于四環(huán)素的合成。而第二條途徑中的草酰乙酸是TCA循環(huán)中的重要中間產物，催化其形成的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的合成受ATP和過量磷酸鹽的強烈抑制，從而降低了草酰乙酸的生成，最終降低了四環(huán)素生物合成前體丙二酰CoA的濃度，影響四環(huán)素的生物合成。,4.6 酶的誘導調節(jié),誘導酶需要有誘導物存在才能形成。 在次級代謝過程中，有些參與次級代謝產物合成的酶為誘導酶，如鏈霉素生物合成中的轉脒基酶、甘露糖鏈霉素酶等。 甘露糖鏈霉素酶的形成需要a甲基甘露糖、甘露聚糖等誘導物的存在，其中以酵母的甘露聚糖的誘導效果為最好。,目前，底物的誘導機理雖然并不完全清楚，但這些誘導物確實起誘導作用，能

14、提高次級代謝產物的產量。,例如，蛋氨酸能提高頭孢菌素C的產量，其原因是蛋氨酸的誘導作用，而不是作為硫源的供給物； 又如，6-氨基葡萄糖-2-去氧鏈霉胺誘導卡那霉素生物合成中卡那霉素乙?；D移酶的合成，它的加入可以提高卡那霉素的產量。,誘導酶合成的誘導劑有些需外源加入，稱外源誘導劑， 有些是菌體代謝過程中自身產生的，則稱內源誘導劑。 在抗生素的發(fā)酵過程中，有的初級代謝產物似乎對次級代謝產物的合成酶也起誘導作用。,47 反饋調節(jié),在次級代謝產物合成中，反饋調節(jié)起著重要作用。一方面是次級代謝產物本身的過量積累，存在著與初級代謝相似的反饋調節(jié)現(xiàn)象。例如，氯霉素作為次級代謝產物阻遏該代謝途徑中的第一個酶

15、芳基胺合成酶，培養(yǎng)液中氯霉素的積累，降低氯霉素的產量；卡那霉素阻遏卡那霉素乙?；D移酶，影響卡那霉素的合成。此外，泰樂菌素、制霉菌素、瑞斯托霉素等抗生素都對本身的合成有抑制作用。,另一方面，初級代謝和次級代謝途徑是緊密相連的，初級代謝受到的反饋調節(jié)，也必然影響次級代謝產物的合成。例如，纈氨酸自身反饋抑制乙酰羥酸合成酶的活性，從而影響了青霉素的合成。分叉中間體對初級代謝終產物的反饋調節(jié)可能影響次級代謝產物的合成。如賴氨酸反饋抑制同型檸檬酸合成酶的活性，抑制了青霉素合成的起始單位a-氨基己二酸的合成，必然影響青霉素的生物合成。,4.8 酶活力調節(jié),酶活力調節(jié)是指一定數(shù)量的酶通過其分子構象或分子結構

16、的改變來調節(jié)其催化反應的速率，一般是通過激活或抑制已有酶的活力來實現(xiàn)，其特點是反應快速。,(1)酶激活作用,酶的激活劑主要是金屬離子，但由于激活只能通過外源提供，不屬于代謝激活。 代謝激活作用是指代謝物對酶的激活，包括前體激活和代謝中間產物的反反饋激活兩種情況。前體激活是指代謝途徑中后面的酶促反應可被此途徑前面的一個中間產物所促進，例如糞鏈球菌。乳酸脫氫酶的活力，可以被前體物質1，6-二磷酸果糖促進。代謝中間產物激活是指代謝中間產物對該代謝途徑的前面酶起激活作用，激活的方式并不多見，較著名的例子是l，6-二磷酸果糖是果糖激酶的激活劑。,(2)酶抑制作用,抑制和激活相反，可降低酶的活力。 在代謝

17、調節(jié)過程中所發(fā)生的抑制現(xiàn)象主要是可逆的，而且大多數(shù)屬于反饋抑制。 反饋抑制是指代謝的末端產物對酶活力的抑制,無分支代謝途徑的調節(jié)：通常是在線形的代謝途徑中末端產物對催化第一步反應的酶活力有抑制作用。 有分支代謝途徑的調節(jié)：即有兩種或兩種以上的末端產物，調節(jié)方式較復雜，其共同特點是每個分支途徑的末端產物控制分支點后的第一個酶，同時每個末端產物又對整個途徑的第一個酶有部分的抑制作用,酶的順序反饋抑制 協(xié)同反饋抑制 累積反饋抑制 增效反饋抑制,酶的順序反饋抑制：分支代謝途徑中的兩個末端產物，不能直接抑制途徑中的第一個酶，而是當末端產物先分別抑制分支點后的反應步驟后，造成中間產物的積累，再由高濃度的中

18、間產物反饋抑制第一個酶。因此只有當兩個末端產物都過量時，才能對第一個酶有抑制作用。如枯草芽孢桿菌合成芳香族氨基酸的抑制作用。 協(xié)同反饋抑制：在分支代謝系統(tǒng)中，幾種末端產物同時都過量時，才對途徑中的第一個酶有抑制作用。它同順序反饋抑制不同之處在于它不通過中間產物積累，而直接作用于第一個酶。如莢膜紅假單胞菌合成天冬氨酸中天冬氨酸激酶受末端產物的反饋抑制作用。,累積反饋抑制：在分支代謝途徑中各種末端產物單獨過量時，它們各自能對途徑中的第一個反應的酶僅產生較小的抑制，即一種末端產物單獨過量并不影響其他末端產物的形成，也只有當幾種末端產物同時過量時，才對途徑中的第一個酶產生較大的抑制作用。如大腸桿菌谷氨

19、酸合成酶受末端產物的調節(jié)作用。 增效反饋抑制：在一個分支代謝途徑中，幾種末端產物單獨過量時，僅產生對共同途徑的第一個酶部分的抑制。而當每種末端產物都過量時，其抑制作用超過各種末端產物單獨抑制的總和。在嘌呤核苷酸生物合成途徑中，5磷酸核糖l焦磷酸的酰胺轉移酶受末端產物的增效反饋抑制。,4.9酶合成調節(jié),酶合成調節(jié)是通過酶量的變化來控制代謝速率水平上起作用，包括酶合成誘導和阻遏兩種類型。,酶合成的誘導,通過誘導合成的酶稱為誘導酶，這種酶只有在補加相應誘導劑(底物)時才能大量合成。 酶合成的誘導作用可表現(xiàn)出協(xié)同誘導和順序誘導兩種情況。,協(xié)同誘導是指一種誘導劑可以同時誘導產生若干種酶的現(xiàn)象，例如半乳糖

20、可以同時誘導產生半乳糖激酶、轉移酶和異構酶。 順序誘導是指一種誘導劑可以連續(xù)誘導產生一系列酶的現(xiàn)象，例如熒光假單胞菌降解芳香族化合物的酶系就是通過順序誘導而產生的。,酶合成的阻遏,阻止酶合成的現(xiàn)象即為酶合成的阻遏，其中阻遏酶合成的物質稱為阻遏物。 酶合成的阻遏分為終點產物反饋阻遏和分解代謝物的阻遏兩種類型，前者是指被阻遏物阻遏合成的酶所催化生成的物質為代謝的終點產物；而后者是指一些被菌體迅速利用的底物或其分解的產物對許多酶合成的抑制作用。,分解代謝物阻遏根據(jù)底物不同，可分為碳分解產物阻遏和氮分解產物阻遏，即指一些被菌體能夠迅速利用的碳源或氮源能阻遏其他某些參與含碳或含氮化合物代謝的酶的合成。,

21、4.10 細胞膜通透性調節(jié),次級代謝中也存在著膜通透性調節(jié)。菌體吸收外界營養(yǎng)物質或分泌細胞內的代謝物都必須經過細胞質膜的運輸。如果細胞對某種物質不能運輸，或是運輸功能發(fā)生了障礙，將導致細胞內合成代謝的產物不能分泌出去，影響發(fā)酵產物的生成和收獲；或者是細胞外的營養(yǎng)物質不能進入菌體或進入很少，從而影響產生菌的生長和產物的合成，造成產量下降。,在青霉素的發(fā)酵中，產生菌細胞膜輸入硫化物的能力是影響青霉素發(fā)酵單位的一個重要因素。誘變選育出來的青霉素高產菌株中，有些變株就是因為改變了細胞膜的通透性，使硫酸鹽更容易透過細胞膜，提高了胞內硫酸鹽濃度，進而促進了青霉素前體物半胱氨酸的合成，最終提高了青霉素的產量

22、。,又如，產生新生霉素的弗氏鏈霉菌和不產生新生霉素的變株相比，兩者細胞膜上的脂肪酸組成不同。,當在培養(yǎng)基中加入油酸鈉和氯化鈉后，經培養(yǎng)后不產新生霉素的變株的細胞膜又恢復成與親株相同的脂肪酸組成，并開始合成新生霉素。進一步分析發(fā)現(xiàn)，變異株細胞膜攝取合成新生霉素所需氨基酸的能力大大降低。,因此，細胞膜通透性是代謝調節(jié)的一個重要方面，可以通過改變某些次級代謝產物產生菌的膜通透性來提高其產量。,11金屬離子和溶解氧的調節(jié),在多數(shù)情況下，微量的金屬離子是參與次級代謝產物合成酶的活化因子，甚至有時在轉錄和轉譯水平上起作用。 例如，Mg2+可以增加卡那霉素合成中的卡那霉素乙?；?、乙?？敲顾匕坊负透ナ?/p>

23、鏈霉菌的堿性磷酸酶的活力，促進這些酶的合成。,另外有些金屬離子(如Mg2+和Ca2+等)可以解除產生菌(卡那霉素、新生霉素和鏈霉素等產生菌)對所產抗生素的特異性吸附作用，使抗生素從菌絲上游離下來，促進產物分泌。 還有一些金屬離子(Mg2+)可增加產生菌對所產抗生素的抗性。,次級代謝產物的發(fā)酵過程需要適量的溶解氧，溶解氧的降低影響次級代謝產物的生物合成。例如，在利用無細胞體系由青霉素N進行頭孢菌素合成時，隨著氧分壓的增大頭孢菌素的合成被促進，同時加入KCN或降低攪拌速度合成量則減少。,45 研究微生物藥物生物合成 機理的主要方法,微生物藥物生物合成機理的研究包括細胞內將一種或幾種初級代謝產物轉化

24、為次級代謝終產物的反應順序，以及該反應系統(tǒng)的調節(jié)機制。通過了解微生物藥物生物合成的機理，可以人為地改變和控制微生物的代謝，大幅度地提高目的產物的產量。,論證生物合成途徑的一般步驟為： 確定構成目的產物的構建單位即生源； 確定生物合成途徑中的關鍵的中間產物，合理地推斷反應順序； 分離鑒別生物合成反應中的關鍵酶。 ,研究方法,喂養(yǎng)實驗法或稱刺激試驗 洗滌菌絲懸浮法 或稱靜息細胞法 阻斷變株法 互補共合成法 同位素標記法 無細胞抽提液法) 酶抑制劑法,遺傳特性誘變法 原生質體試驗法 去阻遏方法,(1)喂養(yǎng)實驗法（或稱刺激試驗）,在發(fā)酵的培養(yǎng)基中，加入某些可能是前體的物質，觀察該物質在發(fā)酵過程中的利用

25、情況與促進目的產物生成的效果。這種方法所得出的實驗結果是很初步的，難以判斷添，例如，所加物質所產生的效果究竟是前體還是刺激作用，需要進一步研究。,(2)洗滌菌絲懸浮法 或稱靜息細胞法,目的:為了排除原培養(yǎng)基自身的代謝物對不同生長階段的影響，簡化代謝物生物合成的研究系統(tǒng)和區(qū)別試驗化合物的作用，常借用洗凈的靜息菌絲體，此時菌體不在分裂過程中，但仍有代謝活力。,試驗時取不同生長階段的菌絲，先洗去沾染的原培養(yǎng)基成分和代謝產物，然后將菌絲懸浮于人工培養(yǎng)系統(tǒng)內，在一定條件下繼續(xù)觀察被試驗的化合物對菌體代謝和對產物生物合成的影響。為避免菌體內含物的干擾，常把洗凈后的菌體懸浮于生理鹽水中，保溫一定時間，盡可能

26、使其內源營養(yǎng)耗盡，然后再在人工培養(yǎng)系統(tǒng)中進行試驗,即饑餓后實驗。采用此法，被試驗的菌體雖然能以基礎原料合成某種代謝物，產量大大減少，但仍可以判斷生物合成過程中的一些反應步驟。,(3)阻斷變株法(block strains),將次級代謝產物產生菌進行誘變處理，篩選出失去產生某種目的代謝產物能力的突變株，即生物合成的阻斷變株。這種阻斷變株能夠積累某種中間代謝產物或支路代謝產物，通過分離、提純、鑒別中間代謝產物，并與目的代謝產物的化學結構相比較，推斷出目的代謝產物的生物合成的反應步驟，然后再分離其反應中的特殊酶類，進一步判斷其生化反應的特性。,(4)互補共合成(cosynthesis)法,應用兩株生

27、物合成阻斷變株，當它們單獨培養(yǎng)時均不能產生目的代謝產物，而將它們進行混合培養(yǎng)時獲得目的產物或者以后某一步中間體，來證明生物合成所經過的途徑，或證明生物合成途徑中確實存在某個中間體，通過分別提取、分離和鑒別阻斷變株積累的中間體和共合成的產物，了解它們的阻斷部位和順序以及反應過程，推斷目的產物的生物合成途徑。,以上方法都受到一定的限制，主要是由于菌體細胞膜和細胞壁的通透性對試驗化合物的影響。有的試驗化合物，雖然確實是產物合成途徑中的前體，但因受細胞壁、細胞膜的通透性的障礙或通過時受細胞壁與細胞膜上酶的作用而引起分子降解或發(fā)生立體構型的改變等，使這類討論中得到了負的結果。所以上述方法所得到的負結果并

28、不能否定它不是生物合成中的前體。,(5)同位素標記法,同位素標記法是確定構成目的產物分子“構建元件”的好方法,即應用同位素合成起始物和中間體進行喂養(yǎng)實驗。 將具有放射性同位素3H或者14C標記的可疑前體物質加入到次級代謝產物產生菌的培養(yǎng)基中：最佳加入時間是微生物生長階段的后期，培養(yǎng)結束后，提取分離目的代謝產物，測定結合到次級代謝產物的同位素含量和分布情況，可以判斷試驗化合物是否參與代謝產物的生物合成。,重要缺點,為了確定同位素的結合位置,還需將產物進行一系列的降解,分離和測定等大量工作.,應用此方法時應注意兩點,一是示蹤物質雖然是目的產物生物合成的前體物質，但由于不能通過細胞壁進入細胞而不能被結合到產物的分子中，將其錯誤地認為不是前體物質；二是雖然在目的產物中檢測到了示蹤物質，但實際是示蹤物質在細胞內被降解，真正結合到目的產物分子的是示蹤物質的降解產物。,(6)無細胞抽提液法(cell-free extraction),要進一步證實反應過程還必須依靠有關酶促反應。通常采用無細胞抽提液來進行下一步實驗。 制備方法是先用適當?shù)姆椒ǎǔ暡ǖ忍幚恚┢扑榧毎?，釋放胞內酶，再經過離心、冷凍干燥，即得到粗酶制品。這種酶制品往往含有多個酶體系，為了排除其他酶對某一種酶反應的干擾，進一步分離純化制得純酶。將制得的純酶和有關物質加入到反應體系，進行酶促反應。檢測反應體系中的底物和產物