體內(nèi)藥物分析常用生物樣品處理方法和方法學(xué)驗(yàn)證ppt課件.ppt

1、體內(nèi)藥物分析的樣品處理和方法驗(yàn)證，1，1。為什么要處理生物樣品？2.有什么生物樣品嗎？3.有什么樣的樣品處理方法？各自的特點(diǎn)。如何驗(yàn)證分析方法？5.什么參考標(biāo)準(zhǔn)？2，生物樣品預(yù)處理的目的是在一劑進(jìn)入體內(nèi)后吸收、分布、代謝、體外排出。體液、組織、糞便中除了玻璃型(原型)藥外，還存在多種形式，如藥物的代謝物質(zhì)、藥物和蛋白質(zhì)的結(jié)合物、藥物或其代謝和內(nèi)源性物質(zhì)(如葡萄糖醛酸、硫酸形成的葡萄糖醛酸、硫酸酯化合物等)，分離后必須測定藥物和代謝物質(zhì)。3，1，處理的目的，2生物樣品的介質(zhì)組成比較復(fù)雜。血清中含有聚合物的蛋白質(zhì)和低分子的糖、脂肪、元素等有機(jī)化合物、Na、K、Cl-等無機(jī)化合物。牙齒成分嚴(yán)重影響測

2、量的準(zhǔn)確性和靈敏度，同時會污染儀器。因此，為了保護(hù)儀器，提高測量的靈敏度，確保測試結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，必須字典處理樣品。超過4，5，60%的能量和成本用于樣品預(yù)處理，生物樣品包含各種體液和組織，但實(shí)際上最常用的是比較容易獲得的血液(全血、血漿、血清)、尿液、糞便、唾液。在某些情況下，使用牛奶、腦脊液等。6，2，生物樣品的種類，全血不易保存，血細(xì)胞中含有更多的干涉物質(zhì)，影響測量，因此很少用全血測量藥物濃度。僅適用于血漿藥物濃度過低或血漿藥物濃度波動嚴(yán)重且難以控制的藥物(如環(huán)孢素A)。7，1全血，血液中藥物濃度的測定一般是指血漿或血清中的藥物濃度，而不是含血細(xì)胞全血中的藥物濃度。將提取的血液放入

3、包含抗凝劑(如肝素、EDTA)的試管中攪拌后，3000 4000 r/min離心機(jī)、血細(xì)胞分離、上清液為血漿。8，2血漿，9，血漿中所含物質(zhì)的種類和比例，血清在采血后不加抗凝劑，在室溫下定15-30 min，自然凝結(jié)后，分離原深海上清液。血清顏色比血漿淺，成分比血漿纖維大部分少，易于處理，血漿和血清的藥物濃度測定值通常相同。10，3血清，一般當(dāng)藥物在體內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)時，血漿中的藥物濃度與作用點(diǎn)的濃度密切相關(guān)，即血漿中的藥物濃度反映了體內(nèi)(靶器官)的狀態(tài)，因此血漿濃度可以用作作用部位藥物濃度的可靠指標(biāo)。血漿和血清可以穩(wěn)定冷凍保存，一般儲存在-20的條件下，在保存器官時可以保存在-80的條件下，是

4、生物樣品檢驗(yàn)中最常用的樣品。11，尿液的主要成分是水，元素，無機(jī)鹽類。采集尿液樣本后，為了保存，經(jīng)常放防腐劑。體內(nèi)藥物去除主要通過尿液排出，藥物可以通過圓形或代謝，其合物等排出。尿液的藥物濃度高，但尿液濃度受尿液量的影響，通常變化很大，所以要測量一段時間內(nèi)排出尿液的藥物總量。12，4尿，唾液中所含的成分比較簡單容易得到，但只有少數(shù)藥物的唾液濃度和血漿玻璃藥物濃度相關(guān)，實(shí)際使用不多。藥物血漿結(jié)合率高時唾液中藥物的濃度很低，很難檢測。13，5唾液，取樣后，除了立即分析外，為了防止藥物的變化，還要進(jìn)行短期保存。4可以冷藏。保留器官，但-20冷凍，不要重復(fù)董潔融化，必要時可以添加酶抑制劑和抗氧化劑。1

5、4、生物樣品的保存：主要應(yīng)考慮生物樣品的種類、所測藥物的性質(zhì)和測定方法三個茄子方面。15，3，常用處理方法，1。沉淀蛋白PPT 2。液體萃取LLE 3 .固相萃取SPE，16，1。沉淀蛋白、有機(jī)溶劑沉淀法可以添加水溶性的有機(jī)溶劑，引起蛋白質(zhì)的分子內(nèi)及分子間氫鍵變化，從而凝聚蛋白質(zhì)。常用有機(jī)溶劑包括乙精、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氫呋喃等。血漿、血清和有機(jī)溶劑的體積比為133603時，可以去除90%以上的蛋白質(zhì)，使用低溫高速離心機(jī)16000r/min離心10min可以完全沉淀出的蛋白質(zhì)。在實(shí)際應(yīng)用中，大部分采用50uL的血漿，添加500uL的有機(jī)溶劑，離心渦流后，取清樣品。沉淀后，如果信號相應(yīng)不

6、好，更換嘗試有機(jī)溶劑或沉淀時加入酸或堿，調(diào)整pH值會對結(jié)果產(chǎn)生很大影響。常用的酸堿：鹽酸、甲酸、乙酸、氨水等。17，優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，是方法開發(fā)中首先要考慮的。缺點(diǎn)：僅用于樣品中濃度高的藥物測定。處理后，樣品中仍然有很多干涉物質(zhì)，妨礙了結(jié)果。剩下的雜質(zhì)能防止色寶熱，污染機(jī)構(gòu)。18，中性鹽可以替換蛋白質(zhì)和水合的水，使蛋白質(zhì)脫水沉淀。常用的中性鹽：飽和硫酸胺、硫酸鈉、鎂鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽等。鹽析法經(jīng)常與有機(jī)溶劑萃取法結(jié)合使用，藥物回收率高。加入中性鹽，19，20，20，然后加入強(qiáng)酸。當(dāng)pH低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時，蛋白質(zhì)以陽離子的形式存在，添加強(qiáng)酸后，蛋白質(zhì)陽離子和不溶性鹽形成沉淀。常用的強(qiáng)酸是10%

7、三氯乙酸等。血清和強(qiáng)酸的比例為1:0.6牙齒混合，可以用高速離心力去除蛋白質(zhì)。在酸性中分解的藥不要用牙齒方法去除蛋白質(zhì)。當(dāng)PH高于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時，金屬陽離子和蛋白質(zhì)分子中帶有負(fù)電荷的羧基形成不溶性鹽沉淀。常用的沉淀劑包括CuS04-Na2W04、ZnS04-NaOH等。含藥血清和沉淀劑的比例為1:2混合，可獲得高速離心、分離后的清液。21，添加鋅鹽或銅鹽沉淀劑，測定部分酸性不穩(wěn)定和蛋白質(zhì)結(jié)合藥物時，經(jīng)常使用酶解法。在測定尿液的藥物濃度時，尿液中的藥物主要以結(jié)合物的形式排除，所以比原藥極性大，不容易被有機(jī)溶劑提取，一般使用酶水解法。22，酶解法，超速離心法平衡透析法最重要的應(yīng)用是測定血漿中游離

8、的藥物濃度和藥物的血漿蛋白結(jié)合率。23，去除蛋白質(zhì)的其他方法：由于藥物在體內(nèi)被吸收，必須通過膜運(yùn)輸，所以大部分藥物具有一定的脂溶性，生物樣品中的內(nèi)源性雜質(zhì)大部分是強(qiáng)極性的水溶性物質(zhì)，因此，根據(jù)藥物分子和底物之間極性的差異，可以使用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑提取藥物，有機(jī)溶劑提取可以一次清除大部分雜質(zhì)。24，2。液萃取法LLE，有機(jī)溶劑應(yīng)選擇穩(wěn)定，揮發(fā)，低毒性，不與水相混合的溶劑。常用有機(jī)溶劑包括乙醚、乙酸乙酯、正己烷、叔丁基甲醚、氯仿等。應(yīng)用本法時，應(yīng)考慮所選有機(jī)溶劑的特性、藥物的特性、有機(jī)溶劑獎、獲獎體積比、獲獎pH值等。酸性藥物的解離：AH2OA-H堿性藥物的解離：B H2O B OH-藥物的解離常數(shù)

9、pKa是藥物在50%釋放時溶液的pH值。25，藥的提取程度主要取決于獲獎的pH值。對于堿性藥物，最佳pH值高于pKa 1-2單位。對于酸性藥物，低于pKa值1-2個單位。這樣，90%的藥物以非溫和的形式存在，更容易溶解在有機(jī)溶劑中。經(jīng)常用于調(diào)節(jié)PH值的物質(zhì)有甲酸、乙酸、鹽酸或氨水、氫氧化鈉等。影響水相PH值-液萃取的最重要因素，26，具體萃取模式有直接萃取法和反萃取法。優(yōu)點(diǎn)：樣品提取后，可以去除大部分雜質(zhì)，比較“干凈”。有機(jī)溶劑蒸發(fā)后再溶解，可以濃縮樣品。大部分藥物具有脂溶性，適用范圍很廣。缺點(diǎn)：時間和努力，繁瑣的操作；然后提取血漿，血漿的脂質(zhì)一起提取，使用質(zhì)譜探測器時離子源產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)，嚴(yán)重

10、阻礙了質(zhì)譜檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性！27，在方法探索中，一般判斷上述溶劑、并行操作、同時提取、額外空白對比、比較結(jié)果，確定哪種有機(jī)溶劑的提取效果最好。如果沒有理想，則可以再次混合上述溶劑，調(diào)整1:1、1:2、1:3的使用。在尋求合適的提取溶劑的過程中，可以根據(jù)藥物的酸堿性添加試劑、堿或離子，以提高回收率。在提取過程中，必須嚴(yán)格控制pH值，對于陽性藥品，應(yīng)使用緩沖溶液保證可靠地再現(xiàn)回收率。28，29，如雌二醇檢查血漿樣本100uL，同位素內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)20uL，甲酸50uL，n-己烷1mL叔丁基甲醚3mL，旋渦振動10min，3000r/min離心10min，-。固相萃取(Solid Phase Extract

11、ion，SPE)是80年代中期開始發(fā)展的樣品預(yù)處理技術(shù)。由液固萃取與液相色譜技術(shù)相結(jié)合開發(fā)。主要通過固相填料，對樣品組進(jìn)行了選擇性吸、解吸過程，實(shí)現(xiàn)了樣品的分離、純化和財(cái)富。主要目的是減少樣品基質(zhì)的干擾，提高檢測靈敏度。30，3。固相萃取SPE，固相萃取的基本原理和方法：SPE技術(shù)基于液-固色頻譜理論，通過選擇性吸附、選擇性洗滌富集、分離、純化樣品，是包括液相和固相的物理萃取過程。也可以將其看作是一個大致的顏色頻譜過程。更常見的方法是通過液體樣品吸附劑保存其中測定的物質(zhì)，用適當(dāng)?shù)膹?qiáng)度溶劑去除雜質(zhì)，然后用少量的洋溶劑沖洗測定的物質(zhì)，快速分離凈化和濃縮。也可以有選擇地吸附雜質(zhì)，使被測試的物質(zhì)流出。

12、31，32，33，提取小支柱，一次性使用，防止交叉污染！固相萃取作業(yè)一般分5個階段：甲醇/乙腈濕潤小柱活化，填料活化；平衡的水或合適的緩沖液洗滌平衡柱；將樣品移到柱子上，抽出廢液。使用浸出液或緩沖液最大限度地清洗障礙物。用洗脫用小溶劑測定的物質(zhì)沖洗和收集。34，1。情色補(bǔ)正原理2。反色補(bǔ)正原理3。根據(jù)離子交換原理，35，原理分類：36，37，SPE方法的優(yōu)點(diǎn)：1。不會發(fā)生油畫。2.覆蓋面廣。萃取效率高。4.方便、快速，可以一次提取和分離多個化合物。溶劑消耗低。自動化很容易。7.離子交換固相萃取利用離子交換原理，與頻譜柱的極性大小分離原理不同，配合使用可以最大限度地分離藥物，消除干擾。目前商品化

13、的固相萃取小柱(cartridge)已得到廣泛應(yīng)用。38，3種茄子方法的比較：將藥物化學(xué)衍生化的目的是使藥物具有可分離的性質(zhì)。提高測試的靈敏度。提高藥物的穩(wěn)定性。提高對映異構(gòu)分離能力等。藥物分子中含有活躍H的人都可以從化學(xué)上導(dǎo)出。例如，-COOH、-OH、-NH2、-NH-、-SH等官能團(tuán)的藥物都可以導(dǎo)出。39，4?；瘜W(xué)衍生化方法，HPLC的化學(xué)衍生化方法(包括柱前衍生化和柱后衍生化)，在柱前衍生化分析之前，盡可能提取和分離藥物，然后衍生，以防止含有相同功能團(tuán)的其他雜質(zhì)影響分離。柱后衍生化通過頻譜柱在藥物分離后進(jìn)行，從而在探測器上形成高靈敏度的衍生物。HPLC法中常用的誘導(dǎo)化試劑(PLC)包括

14、鄰苯二甲醛、甜酒酰氯、熒光胺等。，40，41，定量下限達(dá)到10 pg級！測試中藥物的理化性質(zhì)及體內(nèi)存在狀態(tài)分析測定的目的和生物樣品類型及預(yù)處理方法實(shí)驗(yàn)室條件，42、建立體內(nèi)藥物分析方法，1 .頻譜分析2。色譜法3。毛細(xì)管電泳法4。免疫分析5。同位素方法，43，體內(nèi)藥物分析方法大體可以分為幾個茄子類別：使用44標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品掃描質(zhì)譜條件。3.選擇顏色頻譜柱和流動相，探索適當(dāng)?shù)囊合鄺l件。4.根據(jù)樣品基質(zhì)配方模擬生物樣品，選擇相應(yīng)的樣品處理方法，處理落后樣品分析。5.調(diào)整樣品處理方法或液相條件，添加質(zhì)譜參數(shù)最優(yōu)化6。根據(jù)檢查目的設(shè)定定量范圍，并考察方法。方法驗(yàn)證，生物樣品測量的核心是方法驗(yàn)證。方法確認(rèn)是整

15、個藥代動力學(xué)研究的基礎(chǔ)。這是藥代動力學(xué)研究與其他藥理毒性研究不同的特別之處。所有藥代動力學(xué)研究結(jié)果都依賴于生物樣品的測定，只有可靠的方法才能得到可靠的結(jié)果，因此必須驗(yàn)證已建立的方法。此外，在實(shí)際樣品檢驗(yàn)過程中，必須進(jìn)行方法質(zhì)量控制，準(zhǔn)備伴隨標(biāo)準(zhǔn)曲線，測量品質(zhì)管制樣品，確保測試方法的可靠性。45，46，47，guideline on bio analytical method validation-EMEA，48，49，50，4。補(bǔ)償曲線Calibration curve每個濃度點(diǎn)的準(zhǔn)確度必須在85%到115%之間，精度必須低于15%，定量下限必須在80%到120%之間，以及20%。對于不符合要求的濃度點(diǎn)，可以排除計(jì)算，但至少75%的濃度點(diǎn)符合要求。方法驗(yàn)證期間，統(tǒng)計(jì)應(yīng)至少包括三條合格的標(biāo)準(zhǔn)曲線。51，52，品質(zhì)管制樣品質(zhì)量控制，QC，低濃度品質(zhì)管制(Low QC)濃度不超過LLOQ的3倍。中等濃度品質(zhì)管制濃度通常是定量范圍的中等濃度。高濃度品質(zhì)管制濃度超過ULOQ的75%。品質(zhì)管制樣品建議獨(dú)立人員一次配制，通過樣品分析后，分材、冷凍保管，每次取用足夠數(shù)量的樣品，其余的作廢。53，54，55，8。穩(wěn)定性穩(wěn)定性穩(wěn)定性、8.1分析物和耐表標(biāo)準(zhǔn)儲備(Stock)和標(biāo)準(zhǔn)工作液(Working)