碩士生物儀器分析之熒光.ppt

1、熒光光譜 Fluorescence,幾乎所有物質(zhì)分子都有吸收光譜，但不是所有物質(zhì)都會發(fā)熒光。 產(chǎn)生熒光必須具備以下兩個必要條件：, 該物質(zhì)的分子必須具有能吸收激發(fā)光的結(jié)構，通常是共軛雙鍵結(jié)構。 吸收了與本身特征頻率相同的能量之后的物質(zhì)分子，必須具有高的熒光效率。許多吸光物質(zhì)并不產(chǎn)生熒光，主要是因為它們將所吸收能量消耗于與溶劑分子或其它分子之間的相互碰撞中，還可能消耗于一次光化學反應中，因而無法發(fā)射熒光，即熒光效率很低。,某些物質(zhì)被一定波長的光照射時，會在一定時間內(nèi)發(fā)射出波長比入射光長的光，如果這個時間比較短，這種光就稱為熒光。熒光由一種能發(fā)熒光的礦物 螢石(fluospar)而得名。 我們這里

2、要介紹的熒光，是指物質(zhì)在吸收紫外光和可見光后發(fā)出的波長較長的紫外熒光或可見熒光。 除了紫外光和可見光可能激發(fā)熒光外，其它的光如紅外光、X射線也可能激發(fā)出熒光，因此除紫外熒光或可見熒光外，還有紅外熒光、X射線熒光等。,用熒光抗體染色之原生動物,澳大利亞科學家最新發(fā)現(xiàn)，一種叫“螳螂蝦”的海里動物通過發(fā)出色彩鮮艷的熒光來恐嚇警告敵對者或者吸引性配偶.,K. Brejc et.al., PNAS 94 (1997) 2306,green-fluorescent protein (GFP),2008年諾貝爾化學獎,下村修(Osamu Shimomura)1928年出生于日本京都府，1960年獲得名古屋大

3、學理學博士學位后赴美，先后在美國普林斯頓大學、波士頓大學和伍茲霍爾海洋生物實驗所工作。他1962年從一種水母中發(fā)現(xiàn)了熒光蛋白水母素，被譽為生物發(fā)光研究第一人。,馬丁沙爾菲(Martin Chalfie)出生于1947年，現(xiàn)年61歲，是美國哥倫比亞大學生物學教授。他獲獎的主要貢獻在于向人們展示了綠色熒光蛋白（GFP）作為發(fā)光的遺傳標簽的作用，這一技術被廣泛運用于生理學和醫(yī)學等領域。,瑞典皇家科學院2008年10月8日宣布，美籍華裔科學家錢永健、美國生物學家馬丁沙爾菲和日本有機化學家兼海洋生物學家下村修共同獲得2008年度諾貝爾化學獎，將均分1000萬瑞典克朗（約合140萬美元）獎金。幫助他們獲獎

4、的是綠色熒光蛋白。這種蛋白為生物與醫(yī)學實驗帶來革命，它發(fā)出的熒光像一盞明燈，幫助研究人員照亮生命體在分子層面和細胞層面的諸多反應。,由于綠色熒光蛋白用紫外線一照就發(fā)出鮮艷綠光，研究人員將綠色熒光蛋白基因插入動物、細菌或其他細胞的遺傳信息之中，讓其隨著這些需要跟蹤的細胞復制，可“照亮”不斷長大的癌癥腫瘤、跟蹤阿爾茨海默氏癥（Alzheimers Disease ）對大腦造成的損害、觀察有害細菌的生長，或是探究老鼠胚胎中的胰腺如何產(chǎn)生分泌胰島素的細胞。,蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光,蛋白質(zhì)的熒光主要是色氨酸殘基的熒光。,利用蛋白質(zhì)中的芳香組氨基酸殘基的側(cè)鏈基團具有吸收紫外區(qū)域的入射光從而發(fā)射熒光的特性，研究蛋

5、白質(zhì)在變性或復性過程中整體空間構象的變化。,蛋白質(zhì) 變性,l max,紅移,蛋白質(zhì) 復性,l max,藍移,E.Coil,E.Coil,蛋白質(zhì)的外源熒光,核殼熒光納米顆粒與活細胞的生物親和性研究,HNE1細胞與二氧化硅殼熒光納米顆粒的生物親和性，連續(xù)培養(yǎng)10天，細胞傳代四次。（a）沒有吞噬納米顆粒的細胞；（b）吞噬納米顆粒的細胞。,結(jié)構特點：入射光的激發(fā)光與熒光探測方向垂直 光源：汞燈、氙燈等 (200800 nm) 測能發(fā)射熒光的物質(zhì),Fluorescence spectrometer,Fluorescence Quartz cuvette,UV-vis Quartz cuvette,熒光光

6、譜儀,X射線熒光光譜儀,Fluorescence spectrometer,熒光分光光度計 970CRT型 波長范圍：激發(fā)(EX) 200800 nm； 發(fā)射(EM) 200800 nm； 狹縫：激發(fā)(EX)2、5、10、20nm 4檔； 發(fā)射(EM)2、5、10、20、30、 40nm 6檔信號噪音比： 蒸餾水的拉曼峰S/N比大于100/高靈敏度高信號噪音比，S/N比達100以上； 雙單色器系統(tǒng)結(jié)構； 每臺 97000.00元。,熒光輻射的波長比激發(fā)光波長長，測量到的熒光頻率與入射光的頻率不同； 熒光在各個方向上都有發(fā)射，因此可以在與入射光成直角的方向上檢測； 這樣，熒光不受來自激發(fā)光的本底

7、的干擾，靈敏度大大高于紫外-可見吸收光譜，測量用的樣品量很少，且測量方法簡便。,1. 靈敏度高,2. 能提供較多的參數(shù)，例如激發(fā)譜、發(fā)射譜、峰位、峰強度、熒光壽命、熒光偏振度等。,3. 還可以檢測一些紫外-可見吸收光譜檢測不到的時間過程過程。紫外和可見熒光涉及的是電子能級之間的躍遷，熒光產(chǎn)生包括兩個過程：吸收以及隨之而來的發(fā)射。,熒光光譜法的特點,熒光光譜法在蛋白質(zhì)研究中的應用,1. 利用蛋白質(zhì)的天然熒光檢測蛋白質(zhì)的構象變化 2. 利用熒光探針檢測蛋白質(zhì)的構象變化 3. 測定蛋白質(zhì)的含量 4. 測定酶的活性 5. 研究小分子與蛋白質(zhì)間的相互作用,藥物與蛋白質(zhì)相互作用的熒光光譜法研究概述 槲皮素

8、和蘆丁與牛血清白蛋白相互作用研究 熒光法研究咖啡因和茶堿與牛血清白蛋白相互作用 喹諾酮類藥物對人血清白蛋白的熒光猝滅研究 熒光檢測藻藍蛋白 熒光分光光度法測定餐具洗滌劑中熒光增白劑,標準曲線法 內(nèi)標法,Fluorescence microscope,熒光顯微鏡是以紫外線為光源，用以照射被檢物體，使之發(fā)出熒光，然后在顯微鏡下觀察物體的形狀及其所在位置。 熒光顯微鏡用于研究細胞內(nèi)物質(zhì)的吸收、運輸、化學物質(zhì)的分布及定位等。 細胞中有些物質(zhì)，如葉綠素等，受紫外線照射后可發(fā)熒光；另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線照射亦可發(fā)熒光。 熒光顯微鏡就是對這類物質(zhì)進行定性和定量研究的工具之一。,熒光顯