碩士生物儀器分析之紫外-可見光譜3.ppt

1、光譜和譜學(xué)分析 Spectroscopy and Spectral Analysis,Introduction,光是一種電磁輻射，從波長極短的宇宙射線至波長很長的無線電構(gòu)成一個(gè)連續(xù)光譜。,Introduction,部分電磁輻射范圍 遠(yuǎn)紫外 100200 nm 近紫外 200400 nm 可見光 400800 nm 近紅外 8002500 nm 遠(yuǎn)紅外 25003500 nm,Introduction,譜圖范圍的選擇，決定了儀器采用的光學(xué)組件,紫外可見光譜,UV-Vis Spectrophotometer (UV-Vis),紫外線,紫外線是位于日光高能區(qū)的不可見光線（100-400 nm）,紫外

2、線,根據(jù)生物效應(yīng)的不同，將紫外線按照波長劃分為四個(gè)波段 ：,UVC波段（200275 nm） 短波滅菌紫外線； 穿透能力最弱，無法穿透大部分的透明玻璃及塑料； 對人體傷害很大，短時(shí)間照射即可灼傷皮膚； 長期或高強(qiáng)度照射還會造成皮膚癌； 紫外線殺菌燈。,UVD波段（100200 nm） 真空紫外線； 穿透能力極弱； 臭氧發(fā)生線。,紫外線,UVA波段（320400nm） 長波黑斑效應(yīng)紫外線； 有很強(qiáng)的穿透力，可以穿透大部分透明的玻璃以及塑料； 可直達(dá)真皮層，破壞彈性纖維和膠原蛋白纖維，曬黑； 360 nm波長制作誘蟲燈； 365 nm可用于礦石鑒定、舞臺裝飾、驗(yàn)鈔等場所； 蝦青素能有效消除UVA對

3、皮膚細(xì)胞的傷害 。,UVB波段（275320 nm） 中波紅斑效應(yīng)紫外線； 中等穿透力，波長較短的部分會被透明玻璃吸收； 能促進(jìn)體內(nèi)礦物質(zhì)代謝和維生素D的形成； 長期或過量照射會令皮膚曬黑； 紫外線保健燈、植物生長燈。,優(yōu)點(diǎn)： 消毒殺菌； 促進(jìn)骨骼發(fā)育； 對血色有益； 偶爾可以治療某些皮膚病; 紫外線照射直接影響人體維生素D的合成,紫外線的特點(diǎn),缺點(diǎn)： 使皮膚老化產(chǎn)生皺紋 產(chǎn)生斑點(diǎn) 造成皮膚炎 造成皮膚癌 造成皮膚粗糙,紫外線的應(yīng)用,化學(xué)：涂料固化，顏料固化，光刻，油煙氧化，光觸酶 儀器分析：礦石，藥物，食品分析 生物學(xué)：滅菌，促進(jìn)植物生長，誘殺蚊蟲，人體保健照射,UV-vis spectro

4、scopy is the measurement of the wavelength and intensity of absorption of near-ultraviolet and visible light by a sample.,Ultraviolet and visible light are energetic enough to promote outer electrons to higher energy levels.,The ultraviolet region falls in the range between 190-380 nm. The visible r

5、egion fall between 380-750 nm.,紫外-可見光譜,UV-vis spectroscopy is usually applied to molecules and inorganic ions or complexes in solution.,紫外-可見光譜,The uv-vis spectra have broad features that are of limited use for sample identification but are very useful for quantitative measurements.,分子從電子基態(tài)（S0）躍遷到電子

6、激發(fā)態(tài)（SE）的E遠(yuǎn)大于振動能級及轉(zhuǎn)動能級的E。 電子躍遷所吸收的電磁波是吸收光譜中頻率最高的，即紫外可見光。,分子的總能量是其鍵能(電子能)、振動能和轉(zhuǎn)動能的總和，當(dāng)分子從輻射的電磁波吸收能量之后，分子會從低能級躍遷到較高的能級。,基本原理,基本原理（Basic principle）,多原子分子電子能級和躍遷類型,n *,有機(jī)化合物外層電子為： 鍵的電子； 鍵的電子； 未成鍵的孤電子對n電子；,吸收頻率決定于分子的能級差，其計(jì)算式為： E = h 或 E = hC / 式中 E為分于躍遷前后能級差； 、分別為所吸收的電磁波的頻率及波長； C為光速； h為普朗克常數(shù)。,基本原理（Basic p

7、rinciple）,紫外吸收譜帶的形狀：較寬,分子吸收電磁波能量后,電子從基態(tài) s0躍遷到激發(fā)態(tài), 其同時(shí)伴隨有振動能級的躍遷+轉(zhuǎn)動能級的躍遷,稀薄氣態(tài),濃度增大,低極性溶劑,高極性溶劑,基本原理（Basic principle）,The concentration of an analyte in solution can be determined by measuring the absorbance at some wavelength and applying the Beer-Lambert Law.,朗伯比爾定律,A=吸光度 I0=入射光強(qiáng)度 I=入射光通過樣品后的透射強(qiáng)度 摩爾

8、吸光度（cm-1.m-1） C=摩爾濃度(mol) l=光程(cm),Molar absorptivities may be very large for strongly absorbing compounds ( 10,000) and very small if absorption is weak ( = 10 to 100).,朗伯比爾定律,UV/VIS spectroscopy in microplates (or 96 well),水 乙腈 n-Hexane 正己烷 Isooctane 異辛烷 Cyclohexane 環(huán)己烷 95%乙醇 Methanol 甲醇 Ethyl eth

9、er 乙醚 Dioxane 1,4-二氧六環(huán) 三甲基磷酸酯 Chloroform 氯仿,190 190 200 200 205 205 205 215 215 215 245,常用溶劑的透明界限,Solvent,Lower limit (nm)透明界限,溶劑的選擇： (1) 端吸收 (2) 樣品濃度 (3) 溶質(zhì)和溶劑分子之間的作用力 (4) 溶劑的揮發(fā)性、穩(wěn)定性、精制的再現(xiàn)性等。,生色團(tuán) (chromophore)：產(chǎn)生紫外(或可見)吸收的不飽和基團(tuán)，如CC、CO、NO2等。 助色團(tuán) (auxochrome)：其本身是飽和基團(tuán)(常含雜原子)，它連到生色團(tuán)時(shí)，能使后者吸收波長變長或吸收強(qiáng)度增加

10、(或同時(shí)兩者兼有)，如：OH、 NH2、Cl等。 深色位移 (bathochromic shift)：由于基團(tuán)取代或溶劑效應(yīng)，最大吸收波長變長。深色位移亦稱為紅移(red shift)。 淺色位移 (hypsochromic shift)：由于基團(tuán)取代或溶劑效應(yīng)，最大吸收波長變短。淺色位移亦稱為藍(lán)移(blue shift)。 增色效應(yīng) (hyperchromic effect)：使吸收強(qiáng)度增加的效應(yīng)。 減色效應(yīng) (hypochromic effect)：使吸收強(qiáng)度減小的效應(yīng)。,基本術(shù)語,基本原理（Basic principle）,各類化合物的紫外吸收,1. 簡單分子,A. 飽和的有機(jī)化合物 a

11、. 飽和的碳?xì)浠衔?*躍遷，紫外吸收的波長很短。 b. 含雜原子的飽和化合物 雜原子一般為助色團(tuán)，有n *躍遷。近紫外區(qū)仍無明顯吸收。 硫醚、二硫化物、硫醇、胺、溴化物、碘化物在近紫外有弱吸收，但其大多數(shù)均不明顯。 B. 含非共軛烯、炔基團(tuán)的化合物 都含電子，可以發(fā)生*躍遷，其紫外吸收波長較 *為長，但乙烯吸收在165nm、乙炔吸收在173nm。因此，它們雖名為生色團(tuán)，但若無助色團(tuán)的作用，在近紫外區(qū)仍無吸收。 C. 含不飽和雜原子的化合物 *、 *屬遠(yuǎn)紫外吸收， n *亦屬遠(yuǎn)紫外吸收，不便檢測， 但 n *躍遷在紫外區(qū)，可檢測。吸收強(qiáng)度低，但吸收位置較佳，易于檢測。因此，在紫外鑒定中是不應(yīng)忽

12、視的。,各類化合物的紫外吸收,2. 含有共軛體系的分子,A. 共軛體系的形成使吸收移向長波方向 一般把共軛體系的吸收帶稱為K帶 (源于德文konjugierte)。K帶對近紫外吸收是重要的，因其出現(xiàn)在近紫外范圍，且摩爾吸收系數(shù)也高，一般10000。,B. 共軛醛、酮紫外吸收(K帶)的計(jì)算,各類化合物的紫外吸收,2. 含有共軛體系的分子,C. a, b不飽和酸、酯,各類化合物的紫外吸收,2. 含有共軛體系的分子,一些共軛羧酸的UV吸收： 化合物 實(shí)測值（104） 計(jì)算值 CH2=CHCO2H 200（1.0） CH3CH=CHCO2H 205（1.4） Ph=CHCO2H 220（1.4） 22

13、2（2175） CH3 (CH=CH)2CO2H 254（2.5） 256（3018208） CH3 (CH=CH) 3CO2H 294（3.7） 286（6018208） CH3 (CH=CH)4CO2H 332（4.9） 316（9018208）,各類化合物的紫外吸收,3. 芳香族化合物,A. 苯 苯環(huán)顯示三個(gè)吸收帶，它們均起源于苯環(huán)*的躍遷，如上表所示。 B. 烷基苯 C. 助色團(tuán)在苯環(huán)上取代的衍生物 D. 生色團(tuán)在苯環(huán)上取代的衍生物 NO2CHOCOCH3CO2HCOO-CN E. 多取代苯環(huán) F. 雜芳環(huán)化合物,苯 萘 蒽 苯并蒽,各類化合物的紫外吸收,3. 芳香族化合物,A. 苯

14、苯環(huán)顯示三個(gè)吸收帶，它們均起源于苯環(huán)*的躍遷，如上表所示。 B. 烷基苯 C. 助色團(tuán)在苯環(huán)上取代的衍生物 D. 生色團(tuán)在苯環(huán)上取代的衍生物 NO2CHOCOCH3CO2HCOO-CN E. 多取代苯環(huán) F. 雜芳環(huán)化合物,苯 萘 蒽 苯并蒽,各類化合物的紫外吸收,3. 芳香族化合物,A. 苯 苯環(huán)顯示三個(gè)吸收帶，它們均起源于苯環(huán)*的躍遷，如上表所示。 B. 烷基苯 C. 助色團(tuán)在苯環(huán)上取代的衍生物 D. 生色團(tuán)在苯環(huán)上取代的衍生物 NO2CHOCOCH3CO2HCOO-CN E. 多取代苯環(huán) F. 雜芳環(huán)化合物,苯 萘 蒽 苯并蒽,紫外譜圖的解析, 化合物在220800nm內(nèi)無紫外吸收，說明

15、該化合物是脂肪烴、脂環(huán)烴或它們的簡單衍生物(氯化物、醇、醚、羧酸等)，甚至可能是非共軛的烯。 220250nm內(nèi)顯示強(qiáng)的吸收(近10000或更大)，即存在共軛的兩個(gè)不飽和鍵(共軛二烯或a,b 不飽和醛、酮)。 250290nm內(nèi)顯示中等強(qiáng)度吸收，且常顯示不同程度的精細(xì)結(jié)構(gòu)，說明苯環(huán)或某些雜芳環(huán)的存在。 250350nm內(nèi)顯示中、低強(qiáng)度的吸收，說明碳基或共軛羰基的存在。 300nm以上的高強(qiáng)度吸收，說明該化合物具有較大的共軛體系。若高強(qiáng)度吸收具有明顯的精細(xì)結(jié)構(gòu)。說明稠環(huán)芳烴、稠環(huán)雜芳烴或其衍生物的存在。,提供有關(guān)該化合物的共軛體系或某些碳基等的存在的信息。,藍(lán)移、紅移、pH值影響,紫外可見分光光

16、度儀,主機(jī)由光源（氘燈或鎢燈）、單色器（或雙色器）、樣品室、檢測系統(tǒng)、電機(jī)驅(qū)動、計(jì)算機(jī)接口、電源等部分組成。,.au/creswick/facilities/analyt_lab.html,Instruments: Cary 300, Cary 50 with fiber optic probe,single beam uv-vis spectrophotometer,紫外可見分光光度儀,dual-beam uv-vis spectrophotometer,紫外可見分光光度儀,光譜掃描 如實(shí)地顯示樣品的全波長圖譜，是化學(xué)分析

17、工作者的常規(guī)分析手段。 參數(shù)設(shè)置： A、光度范圍： B、取樣間隔： C、掃描速度： 測量運(yùn)行： 比色皿(cuvette)校正,定性分析,單波長標(biāo)準(zhǔn)系數(shù)法 雙波長等吸收點(diǎn)法 雙波長系數(shù)倍率法 三波長法,定量分析,Beer-Lambert Law,朗伯比爾定律,A=吸光度 I0=入射光強(qiáng)度 I=入射光通過樣品后的透射強(qiáng)度 摩爾吸光度（cm-1.m-1） C=摩爾濃度(mol) l=光程(cm),標(biāo)準(zhǔn)曲線法,在決定一系列維生素、抗菌素及一些天然物結(jié)構(gòu)曾起過重要作用，如維生素A1、A2、B12、B1、青霉素、鏈霉素、土霉素、螢火蟲尾部的發(fā)光物質(zhì)（是由熒光酶(luciferase)作為酶催化底物分子熒光

18、素(luciferin)）等。 紫外吸收光譜用來決定雙鍵的位置，既簡單又有效，例如：,松香酸 235248nm,左旋海松酸 260283nm,紫外光譜應(yīng)用舉例,For the spectrum on the right, a solution of 0.249 mg of the unsaturated aldehyde in 95% ethanol (1.42 10-5 M) was placed in a 1 cm cuvette for measurement. Using the above formula, = 36,600 for the 395 nm peak, and 14,0

19、00 for the 255 nm peak. Note that the absorption extends into the visible region of the spectrum, so it is not surprising that this compound is orange colored.,Typical UV / VIS spectum of chlorophyll a in dry diethyl ether on a Shimadzu Spectrophotometer UV 3101.,http:/www.ch.ic.ac.uk/local/projects

20、/steer/chloro.htm,Typical UV / VIS spectum of chlorophyll a in dry diethyl ether on a Shimadzu Spectrophotometer UV 3101.,http:/www.ch.ic.ac.uk/local/projects/steer/chloro.htm,UV-vis spectrum of bisulphide in sewage,二硫化物,(下水道里的)污物,p-硝基苯酚降解的UV-Vis光譜圖,The n electrons (or the nonbonding electrons) are

21、the ones located on the oxygen of the carbonyl group of tetraphenyclopentadienone. Thus, the n to pi* transition corresponds to the excitation of an electron from one of the unshared pair to the pi* orbital.,/bacher/UV-vis/uv_vis_tetracyclone.html.html,Tetraphenylcyclopentadie

22、none 四苯基環(huán)戊二烯酮,/TFrey/Bio750/UV-VisSpectroscopy.html,Protein absorbances come from 3 sources,1. Peptide Bond,Asp, Glu, Asn, Gln, Arg, and His sidechains have absorption in this region also (190 - 230 nm) but is very weak compared to peptide bond p - p*. Absorption in the 190-230

23、 nm region can be and is used to quantitate protein/peptide concentrations, but this is complicated by many compounds used in buffers which also absorb at these wavelengths.,What about Proteins?,What about Proteins?,Phe e250 = 400 symmetry forbidden p - p* Tyr e274 = 1400 p - p* Trp e280 = 4500 at l

24、east 3 different transitions. A280 is one of the most commonly used methods to measure protein concentration (aside from colorimetric methods such as the Lowry or Bradford dye binding assays), but this method is obviously very sensitive to differences in amino acid composition.,2. Aromatic Amino Aci