細胞懸浮培養(yǎng)課件.ppt

1、,植物細胞 懸浮培養(yǎng)技術,單細胞的分離,由完整的植物器官分離單細胞 由培養(yǎng)組織（如愈傷組織） 中分離單細胞,1 由完整的植物器官分離單細胞,機械法 酶解法,葉片是分離單細胞的最好材料,1.1 機械法,方法A：用刀片刮葉片 (花生成熟葉片),具體方法:,方法B：葉片研碎、離心,研磨介質(zhì)：40ml 20umol Sucrose 10umol MgCl2 20umol trisHCL (三羥甲基氨基甲烷 ) PH 7.8 注意：只有薄壁組織排列松散，細胞間結觸點很少時用機械法分離葉肉細胞才能取得成功。,注意：大麥、小麥和玉米很難通過酶解法使細胞分離。 （葉肉細胞伸長，并在許多地方收縮，細胞間形成一種

2、互鎖結構）,事例 分離籬天劍葉肉細胞的機械方法,10ml培養(yǎng)基 1.5克1cm2葉片,低速，去碎屑，游離細胞沉降,1.2 酶解法,Takebe等（1968）最早報道：用果膠酶處理可以分離大量的葉肉細胞,1.3 機械法和酶解法比較,機械法,酶解法,細胞不受到酶的傷害； 不用質(zhì)壁分離； 細胞產(chǎn)量低； 細胞易破。,細胞受到酶的傷害； 要質(zhì)壁分離； 細胞產(chǎn)量高； 細胞不易破。,2 由培養(yǎng)組織（愈傷組織）分離單細胞,材料：胡蘿卜肉質(zhì)根,步驟：,1 誘導產(chǎn)生愈傷組織 2 愈傷組織反復繼代，使組織不斷增殖，提高愈傷組織的松散性；,搖床用于振蕩,3 Subculture 將愈傷組織在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，建立懸浮

3、培養(yǎng)物,優(yōu)點：細胞團成小細胞團或單細胞；在培養(yǎng)基中均勻分布；有空氣交流。,植物細胞懸浮培養(yǎng) 技術 （Suspension culture）,特點： 細胞可以不斷增殖，形成高密度的細胞群體，適于大規(guī)模培養(yǎng)； 能夠提供大量較為均勻的細胞，為研究細胞的生長、分化創(chuàng)造方法和條件。 必須指出：懸浮培養(yǎng)中既有單細胞，也有小細胞團。,概念：是指一種在受到不斷搖動的液體培養(yǎng)基里，培養(yǎng)單細胞及小細胞團的組織培養(yǎng)系統(tǒng)。,1、起始懸浮液的制備,2、懸浮培養(yǎng)的基本形式,分批培養(yǎng) 連續(xù)培養(yǎng),2.1 分批培養(yǎng)（Batch culture）,2.1.1 含義：將細胞分散在一定容積的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。 在培養(yǎng)過程中除了氣體和

4、揮發(fā)性代謝產(chǎn)物可以同外界空氣交換外，一切都是密閉的。 它是進行細胞生長和細胞分裂的生理生化研究常用的培養(yǎng)方法。,2.1.2 特點,培養(yǎng)基體積固定 當培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)耗盡時，細胞的分裂和生長也停止 必須適當攪拌,2.1.3 繼代的方法和最佳時期,繼代方法：用注射器或移液管吸取一定量的含單細胞和小細胞團的懸浮培養(yǎng)物，并移到含有新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶里，繼續(xù)進行培養(yǎng)。 注意：要適當稀釋,最佳繼代時期： 選擇指數(shù)生長期和直線生長期。,2.1.4 細胞生長曲線,在整個培養(yǎng)過程中，細胞數(shù)目不斷發(fā)生變化，呈現(xiàn)出明顯的由慢到快，再到慢，最后增長停止的細胞周期。 細胞的生長呈S形曲線,滯后期 (lag phase

5、),指數(shù)生長期 (exponential phase),直線生長期 (linear phase),減慢期 (progressive deceleration phase),靜止期 (stationary phase),1,2,3,4,5,滯后期 (lag phase),細胞很少分裂，其時間長短取決于在繼代時原種培養(yǎng)細胞所處的生長期和轉(zhuǎn)入細胞數(shù)量的多少,1,指數(shù)生長期 (exponential phase),細胞分裂活躍，細胞數(shù)目迅速增加,2,直線生長期 (linear phase),細胞生長和發(fā)育最快的時期,3,減慢期 (progressive deceleration phase),由于培養(yǎng)

6、基中某些營養(yǎng)物質(zhì)已經(jīng)耗盡，或是由于有毒代謝產(chǎn)物的積累，細胞的增長逐漸減慢,4,生長幾乎處于停止狀態(tài)，細胞數(shù)目增加極少，甚至開始死亡。,靜止期 (stationary phase),5,小結： （1）滯后期的長短主要取決于在繼代時原種培養(yǎng)細胞所處的生長期和轉(zhuǎn)入細胞數(shù)量的多少。 （2）加入條件培養(yǎng)基可以縮短滯后期。 條件培養(yǎng)基：曾培養(yǎng)過一段時間組織或細胞的培養(yǎng)基。 （3）縮短兩次繼代時間間隔，則可使懸浮培養(yǎng)的細胞一直保持指數(shù)生長期。 （4）如果使處在靜止期的細胞懸浮液保持時間太長，則會引起細胞的大量死亡和解體。,操作注意事項： 對懸浮培養(yǎng)細胞繼代時，進液口的孔徑要小，只能通過單細胞或小細胞團（24

7、細胞），使用吸管或注射器。 繼代前，培養(yǎng)容器靜置短時間，大細胞團沉降，再吸上層懸浮液。依此，多次，可建立良好的細胞懸浮培養(yǎng)物。,2.2 連續(xù)培養(yǎng)（Continuous culture）,加入培養(yǎng)基,排出培養(yǎng)基及其培養(yǎng)物,二者體積相等,分：開放式連續(xù)培養(yǎng) 封閉式連續(xù)培養(yǎng),開放式和封閉式區(qū)別,封閉式中：排出液中的細胞用機械方法收集后，又放入原培養(yǎng)基，所以其培養(yǎng)細胞數(shù)目不斷增加； 開放式中：在注入新鮮培養(yǎng)基的同時，培養(yǎng)細胞隨同培養(yǎng)液一起流出 。,連續(xù)培養(yǎng)意義： 植物細胞代謝調(diào)節(jié)的研究 某種生長限制因子對細胞生長的影響 次生物質(zhì)的大量生產(chǎn) 紫杉醇是獲得美國FDA(1992)認證的優(yōu)良抗腫瘤藥物。紅豆杉

8、樹皮中紫杉醇的含量為萬分之二，其在國際市場上售價為20萬美元/kg,由懸浮細胞再生植株的途徑,由懸浮細胞直接形成體細胞胚 先將懸浮細胞在半固體培養(yǎng)基上誘導形成愈傷組織，然后再由愈傷組織分化植株,3 細胞懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基,3.1 懸浮培養(yǎng)對培養(yǎng)基的要求 能用來建立生長快、易散碎的愈傷組織的培養(yǎng)基，一般也適用于建立該物種的懸浮培養(yǎng)。 在活躍生長的懸浮培養(yǎng)物中，無機磷酸鹽的消耗很快，不久成為限制因子。,Noguchi等(1977)證明，把煙草懸浮培養(yǎng)物保存在一種含有標準的MS無機鹽培養(yǎng)基中，培養(yǎng)開始3d之內(nèi)無機磷酸鹽的濃度就幾乎下降為零，即使把培養(yǎng)基中磷酸鹽的濃度提高到原來的水平的3倍，5d之內(nèi)也會

9、被細胞全部用完。 高等植物的懸浮培養(yǎng)，B5和ER培養(yǎng)基。,3.2 條件培養(yǎng)基,把在液體培養(yǎng)基里 培養(yǎng)46周的高濃度細胞濾掉，而用他的培養(yǎng)基制成懸滴或薄層來培養(yǎng)單細胞或低密度細胞群體。,3.3 培養(yǎng)基的振蕩,防治細胞缺氧死亡 防治大的細胞團的形成,3.4 懸浮培養(yǎng)細胞的同步化,同步培養(yǎng)： 指在培養(yǎng)中大多數(shù)細胞都能同時通過細胞周期的各個階段。 應用：為了便于研究細胞分裂和細胞代謝,3.4.1 物理方法,A 按細胞團的大小 通過對細胞物理特性（細胞或小細胞團的大小）的控制，以實現(xiàn)高度的同步化 B 低溫休克法 通過對生長環(huán)境條件（光照、溫度等）的控制，以實現(xiàn) 高度的同步化,3.4.2 化學方法,A 饑

10、餓法 先對細胞斷絕一種細胞分裂所必須的營養(yǎng)物質(zhì)成分或激素，使細胞停滯在G1或G2期，經(jīng)過一段時間的饑餓后，當重新在培養(yǎng)基中加入這種限制因子時，靜止細胞就會同步進入分裂。,細胞周期（cell cycle)是指細胞從第一次分裂結束產(chǎn)生新細胞到第二次分裂結束所經(jīng)歷的全過程，分為間期與分裂期兩個階段。 間期又分為三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）與DNA合成后期（G2期）。 細胞分裂期：前期，中期，后期，末期,3.4.2 化學方法,B 抑制法 使用DNA合成抑制劑，如5-氨基尿嘧啶、羥基尿和胸腺嘧啶脫氧核苷 當細胞受到化學藥物抑制時，細胞周期只能進行到G1，細胞滯留在G1期S期的邊

11、界上。,4 懸浮培養(yǎng)中細胞生長量的計算,細胞計數(shù) 細胞密實體積（PCV）,5鉻酸或0.25果膠酶使懸浮細胞團分散 用血球計數(shù)板進行。,將體積已知、均勻分散的懸浮液放入一個 15ml 的離心管中，3000rpm離心，用每毫升培養(yǎng)液中細胞總體積的毫升數(shù)表示。,細胞鮮重 細胞干重,細胞鮮重：細胞培養(yǎng)物過濾，洗去培養(yǎng)基，真空抽濾，稱重。 細胞干重：60干燥12h，稱重。 以每毫升培養(yǎng)物或106個細胞的重量表示。,5 培養(yǎng)細胞活力的測定,相差顯微術法 TTC法（2,3,5-氯化三苯基四氮唑） FDA法（熒光素雙醋酸酯法） 伊凡藍法(Evans blue)（FDA的互補法）,根據(jù)細胞質(zhì)環(huán)流和細胞核存在與否，鑒別細胞的死活。 環(huán)流正常、核存在表明有活力；,在活細胞中，TTC被還原成紅色甲鐟，提取甲鐟用分光光度計檢測。,活力受損的細胞能夠攝取這種染料，完整的活細胞則不能，凡染藍色的細胞是不具有活力的細胞,FDA法的原理,FDA本身不具有極性，不能發(fā)出熒光，可以自由出入細胞膜。 在活細胞中，F(xiàn)DA被酯酶裂解，釋放出有極性的熒光素。 熒光