分子水平上的基因功能上.ppt

1、第五章 分子水平上的基因功能,5.1關(guān)于 遺傳物質(zhì)本質(zhì)研究的歷史回顧,遺傳物質(zhì)是DNA 1. DNA含量的恒定性（每個(gè)物種不同組織的細(xì)胞不論其大小和功能如何，它們的DNA含量是恒定）； 2. DNA代謝的穩(wěn)定性（DNA在代謝上是比較穩(wěn)定的）； 3. DNA是所有生物染色體所共有的； 4. 基因突變與紫外線誘變波長(zhǎng)的關(guān)系； 用不同波長(zhǎng)的紫外線誘發(fā)各種生物突變時(shí)，其最有效的波長(zhǎng)為2600埃，這與DNA所吸收的紫外線光譜是一致的，證明基因突變與DNA分子的變異密切相關(guān)。,5.1.1 肺炎球菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),5.1.2 Hershey和Chase的實(shí)驗(yàn),結(jié)果與結(jié)論,試驗(yàn)結(jié)果表明： 主要是由于DNA進(jìn)入細(xì)胞

2、內(nèi)才產(chǎn)生完整的噬菌體； 結(jié)論：DNA才是(噬菌體的)遺傳物質(zhì)。 題外話： 與Avery等人研究比較，本試驗(yàn)的精度低得多。但是由于放射性標(biāo)記法(也稱為示蹤原子法)，當(dāng)時(shí)為人們普遍采用； 同時(shí)由于核酸研究及其它相關(guān)的成果，本試驗(yàn)結(jié)果很快得到人們的廣泛認(rèn)同。,5.1.3 煙草花葉病毒拆合試驗(yàn),煙草花葉病毒(TMV)是由RNA與蛋白質(zhì)構(gòu)成的管狀微粒（如圖）： 中心是單鏈螺旋RNA、外部是蛋白質(zhì)外殼。 1. 拆分感染試驗(yàn)： 將TMV的RNA與蛋白質(zhì)分離、提純； 分別接種煙葉，發(fā)現(xiàn)RNA能使煙葉致病，而蛋白質(zhì)不能； 用RNA酶處理RNA后接種煙葉也不能致病，表明RNA可能就是TMV的遺傳物質(zhì)。,重組合試驗(yàn)

3、,Frankel-Conrat, Singer (1956)進(jìn)行了圖示試驗(yàn)： 綜上所述：到上世紀(jì)中期，多方面證據(jù)都直接或間接地表明DNA是主要的遺傳物質(zhì)，而在缺乏DNA的某些病毒中RNA就是遺傳物質(zhì)。,5.2DNA的基本性質(zhì),5.2.1DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu) DNA分子是脫氧核苷酸的多聚體，含有4種脫氧核苷酸：脫氧腺嘌呤核苷酸(dATP)、脫氧胸腺嘧啶核苷酸 (dTTP)、脫氧鳥嘌呤核苷酸 (dGTP)、脫氧胞嘧啶核苷酸 (dCTP)。,1953年，瓦特森(Watson, J. D.)和克里克(Crick, F.)根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)的規(guī)律以及對(duì)DNA分子的X射線衍射研究的成果，提出了著名的DNA雙螺

4、旋結(jié)構(gòu)模型(圖37)。 這個(gè)模型最主要特點(diǎn)有： (1)由兩條互補(bǔ)的多核苷酸鏈以右手螺旋的形式，彼此以一定的空間距離，平行地環(huán)繞于同一軸上，很象一個(gè)扭曲起來(lái)的梯子。,(2)兩條多核苷酸鏈走向?yàn)榉聪蚱叫?。即一條鏈磷酸二脂鍵為53方向，而另一條為35方向，二者剛好相反。 (3)每條長(zhǎng)鏈的內(nèi)側(cè)是扁平的盤狀堿基，堿基一方面與脫氧核糖相聯(lián)系，另一方面通過(guò)氫鍵與它互補(bǔ)的堿基相聯(lián)系，相互層疊宛如一級(jí)一級(jí)的梯子橫檔?；パa(bǔ)堿基對(duì)A與T之間形成兩對(duì)氫鍵，而C與G之間形成三對(duì)氫鍵(圖38)。上下堿基對(duì)之間的距離為3.4nm。,(4)每個(gè)螺旋為3.4nm長(zhǎng)，剛好含有10個(gè)堿基對(duì)，其直徑約為2nm。 (5)在雙螺旋分子的

5、表面大溝和小溝交替出現(xiàn)。 由此可知，DNA的分子結(jié)構(gòu)是由A-T和C-G兩種核苷酸對(duì)從頭到尾連接起來(lái)的，每個(gè)DNA分子一般有上萬(wàn)個(gè)這兩種核苷酸對(duì)，但是它們?cè)诜肿渔渻?nèi)排列的位置和方向只有以下四種形式: 對(duì)一特定物種的DNA分子來(lái)說(shuō)，其堿基順序是一定的，并且通常保持不變，這樣才能保持該物種遺傳特性的穩(wěn)定。只有在特殊的條件下，改變其堿基順序或位置或以堿基類似物代替某一堿基時(shí)，才出現(xiàn)遺傳的變異(突變)。,5.2.2 DNA的復(fù)制,(一)半保留復(fù)制,半保留復(fù)制(semiconservative replication)-復(fù)制時(shí)DNA雙鏈解開并以每一單鏈為模板來(lái)形成另一對(duì)應(yīng)的新鏈。,5.2.2.1DNA自身

6、的復(fù)制方式-半保留復(fù)制,5.2.2.2復(fù)制起點(diǎn)和復(fù)制方向,多數(shù)細(xì)菌及病毒，只有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，控制整個(gè)染色體的復(fù)制。所以整個(gè)染色體也就是一個(gè)復(fù)制子。,復(fù)制子(replicon)。是指在同一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)控制下合成的一段DNA序列。,在真核生物中，每條染色體的DNA復(fù)制則是多起點(diǎn)的，多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)共同控制一條染色體的復(fù)制，即每條染色體有多個(gè)復(fù)制子。,真核生物的研究發(fā)現(xiàn)，其復(fù)制也是雙向的。但近來(lái)發(fā)現(xiàn)，并不是所有的生物DNA的復(fù)制都是雙向的，如：噬菌體T2，其DNA的復(fù)制就是沿一個(gè)方向進(jìn)行的。5/ 3/,大腸桿菌和其它許多原核生物的環(huán)狀DNA復(fù)制是雙向的。即DNA的復(fù)制從復(fù)制起點(diǎn)開始，向二個(gè)方向同時(shí)進(jìn)行，最

7、后相遇，完成復(fù)制。,復(fù)制方向？從起點(diǎn)開始是沿著一個(gè)方向進(jìn)行的呢？還是雙向的？,二、原核生物DNA合成,(一)有關(guān)DNA合成的酶,1957年科恩伯格(Kornberg, A.)及其同事，從大腸桿菌中分離DNA聚合酶(polymerase )。,聚合酶在有DNA、4種脫氧核苷酸及Mg+的情況下，在離體條件下可以合成DNA。,后來(lái)發(fā)現(xiàn)，DNA聚合酶只有在引物DNA提供3端自由羥基的情況下，才使DNA鏈從5向3方向延伸。,實(shí)際上在此實(shí)驗(yàn)體系中的DNA起著模板和引物的雙重作用。,DNA聚合酶由一條多肽鏈組成，含有928個(gè)氨基酸，分子量約為109,000道爾頓，編碼此酶的基因?yàn)閜ol A。,后來(lái)，從pol

8、 A基因突變株中又分離出二種DNA聚合酶，分別命名為DNA聚合酶I和DNA聚合酶。,三種DNA聚合酶有一些共同的特性，從而決定DNA合成的特點(diǎn)：,1、三種酶都只有53聚合酶的功能，而沒有35聚合酶功能，說(shuō)明DNA鏈的延伸只能從5向3端進(jìn)行。,2、它們都沒有直接起始合成DNA的能力，只能在引物存在下進(jìn)行鏈的延伸，因此，DNA的合成必須有引物引導(dǎo)才能進(jìn)行。,3、三種酶還都有核酸外切酶的功能，可對(duì)合成過(guò)程中發(fā)生的錯(cuò)識(shí)進(jìn)行校正，從而保證DNA復(fù)制的高度準(zhǔn)確性。,(二)DNA復(fù)制的過(guò)程,DNA的合成是半保留復(fù)制（ 分別以兩條鏈互為模板，而合成兩條互補(bǔ)新鏈），復(fù)制是雙向的，DNA的合成必須有引物的引導(dǎo)，并

9、且復(fù)制時(shí)鏈的延伸總是從5向3方向進(jìn)行。,DNA的合成過(guò)程：,1、DNA雙螺旋的解鏈,ATP提供能量，DNA雙鏈由解旋酶解開后，單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）馬上結(jié)合在分開的單鏈上，從而保持其伸展?fàn)顟B(tài)。,在大腸桿菌中，DNA的合成速度每分鐘約為30,000bp，即雙螺旋每分鐘必須旋轉(zhuǎn)3000次才能完全解旋。,如果沒有SSB的作用，分開的雙鏈互補(bǔ)堿基對(duì)間又可重新配對(duì)?；蛘?，在同一條鏈的互補(bǔ)堿基對(duì)間配對(duì)而形成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)會(huì)阻止DNA聚合酶的作用。,隨著解鏈的進(jìn)行，在DNA復(fù)制叉前面就會(huì)形成一種張力，而導(dǎo)致超螺旋的產(chǎn)生。,DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶將DNA雙鏈切開一個(gè)口子，使一條鏈旋轉(zhuǎn)一圈，然后再將其共價(jià)

10、相連，從而消除其張力。,現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)主要有二類DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶：,DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I，只對(duì)雙鏈DNA中的一條鏈進(jìn)行切割，產(chǎn)生切口(nick)，每次切割只能去除一個(gè)超螺旋，此過(guò)程不需要外加能量。,DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II，可以對(duì)雙鏈DNA的二條鏈同時(shí)進(jìn)行切割。每次切割可以去除二個(gè)超螺旋，此過(guò)程需要ATP提供能量。,2、DNA合成的開始,由于三種DNA聚合酶均需要DNA模板和3端的自由OH，才能進(jìn)行DNA的合成，使DNA延伸。,人們很早就發(fā)現(xiàn)RNA聚合酶(RNA ploymerase)利用DNA模板，不需要特殊的引物可以直接合成RNA。,DNA合成前，以DNA為模板，根據(jù)堿基配對(duì)的原則，在一種特殊的RNA

11、聚合酶DNA引物酶(DNA primase)的催化下，先合成一段長(zhǎng)度為560個(gè)核苷酸的RNA引物，提供3端自由OH。,然后，在DNA聚合酶III的作用下進(jìn)行DNA的合成。,3、一條DNA鏈連續(xù)合成，一條鏈不連續(xù),從電子顯微鏡和放射自顯影的結(jié)果可知，DNA兩條新鏈的合成是從一個(gè)復(fù)制叉(replicating fork)向著同一個(gè)方向延伸的。,而組成DNA雙螺旋的互補(bǔ)雙鏈具有相反的方向，一條從53，而另地條35，為反向平行。,二條DNA新鏈，只有一條DNA鏈的合成是連續(xù)的，而另一條則是不連續(xù)的。,所以從整個(gè)DNA分子水平來(lái)看，DNA二條新鏈的合成方向是相反的，但是都是從5向3方向延伸。,把一直從5

12、向3方向延伸的鏈稱作前導(dǎo)鏈(leading strand)，它是連續(xù)合成的。,另一條先沿53方向合成一些片段，然后再由連接酶將其連起來(lái)的鏈，稱為后隨鏈(lagging strand)，其合成是不連續(xù)的(圖319)。,在前導(dǎo)鏈上，DNA引物酶只在起始點(diǎn)合成一次引物RNA，DNA聚合酶III就可開始進(jìn)行DNA的合成。,每個(gè)“岡崎片段”的合成都需要先合成一段引物RNA，然后DNA聚合酶III才能進(jìn)行DNA的合成。,隨后，引物RNA被切除，并為新合成的DNA片段所替代。,在大腸桿菌中，引物RNA被切除過(guò)程是在DNA聚合酶的催化下完成的。,后隨鏈上合成的DNA不連續(xù)單鏈小片段稱為岡崎片段,后隨鏈DNA的

13、合成：,因?yàn)镈NA聚合酶I有53端核酸外切酶的功能，它可以將RNA引物切除，,同時(shí)利用其53聚合酶功能，以臨近“岡崎片段”的3端自由OH進(jìn)行DNA的合成，從而將RNA引物替換為DNA鏈。,最后由DNA連接酶(DNA ligase)將“岡崎片段”連接起來(lái)，形成一條完整的新鏈。,最后，簡(jiǎn)要說(shuō)明一下RNA病毒中RNA的自我復(fù)制。大多數(shù)RNA病毒是單鏈的。,這種RNA的復(fù)制一般是先以自己為模板合成一條互補(bǔ)的單鏈，通常稱病毒原有的，起模板作用的鏈稱為“”鏈，而新復(fù)制的RNA鏈稱為“”鏈，這樣就形成了雙螺旋的復(fù)制類型。,然后這個(gè)“”鏈又從“”鏈模板釋放出來(lái)，它也以自己為模板復(fù)制出一條與自己互補(bǔ)的“”鏈，于

14、是形成了一條新生的病毒RNA。,三、真核生物DNA合成,現(xiàn)在已有很多證據(jù)表明，真核生物DNA的復(fù)制基本上與原核生物相同，但比原核生物更為復(fù)雜。,真核生物DNA的復(fù)制與原核生物主要不同點(diǎn)：,1、DNA合成只是發(fā)生在細(xì)胞周期的某個(gè)時(shí)期：,真核細(xì)胞DNA的合成只是在細(xì)胞周期的S期進(jìn)行。 而原核生物則在整個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中都可進(jìn)行DNA合成。,2、原核生物DNA的復(fù)制是單起點(diǎn)的，而真核生物染色體的復(fù)制則為多起點(diǎn)的。,3、真核生物DNA合成所需的RNA引物及后隨鏈上合成的“岡崎片段”的長(zhǎng)度比原核生物要短,4、有二種不同的DNA聚合酶分別控制前導(dǎo)鏈和后隨鏈的合成(圖321)。,在原核生物中有DNA聚合酶I、

15、II和III等三種聚合酶，并由聚合酶III同時(shí)控制二條鏈的合成。,而在真核生物中共有、和等五種DNA聚合酶。,聚合酶和是DNA合成的主要酶，由聚合酶控制不連續(xù)的后隨鏈的合成，而聚合酶則控制前導(dǎo)鏈的合成，所以其二條鏈的合成是在二種不同的DNA聚合酶的控制下完成。,5、染色體端體的復(fù)制,原核生物的染色體大多數(shù)為環(huán)狀，而真核生染色體為線狀。,端體：染色體其末端有特殊DNA序列組成的結(jié)構(gòu)稱為。,根據(jù)DNA合成的過(guò)程，新鏈5末端DNA是無(wú)法自動(dòng)合成的，因?yàn)楫?dāng)末端的RNA引物被切除后，就沒有3端的自由羥基為DNA的合成作引物。,在DNA的末端存在特殊的結(jié)構(gòu)，并在含有RNA的端體酶(telomerase)的

16、催化下完成末端的合成。,主要不同點(diǎn)：,5.3基因的分子結(jié)構(gòu),5.3.1外顯子和內(nèi)含子 隨著基因結(jié)構(gòu)和功能的深入研究，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了幾種特殊的基因 。 生物遺傳和早期分子遺傳認(rèn)為基因是一個(gè)連續(xù)的、完整的結(jié)構(gòu)。1977年Doel研究表明： 卵清蛋白基因中間存在不表達(dá)的堿基序列，表明基因的DNA序列可能是不連續(xù)的。 外顯子：參加蛋白質(zhì)編碼的DNA片段； 內(nèi)含子：不參加蛋白質(zhì)編碼的DNA片段。 真核生物基因可能是不同外顯子的組合斷裂基因。,斷裂基因或隔裂基因,斷裂基因或隔裂基因,斷裂基因或隔裂基因,、經(jīng)典遺傳關(guān)于基因的概念：,一、基因的概念及其發(fā)展：,基因的共性（按照經(jīng)典遺傳學(xué)對(duì)基因的概念）：, 染色體

17、特性：自我復(fù)制能力和相對(duì)穩(wěn)定性，在分裂時(shí) 有規(guī)律地進(jìn)行分配。,交換單位：基因間能進(jìn)重組，而且是交換的最小單位。,突變單位：一個(gè)基因能突變?yōu)榱硪粋€(gè)基因。,功能單位：控制有機(jī)體的性狀。,經(jīng)典遺傳學(xué)認(rèn)為：基因是一個(gè)最小的單位，不能分割； 既是結(jié)構(gòu)單位，又是功能單位。,、分子遺傳學(xué)關(guān)于基因的概念：,揭示遺傳密碼的秘密：基因 具體物質(zhì)。,基因不是最小遺傳單位 更復(fù)雜的遺傳和變異單位：,具體內(nèi)容：,或?qū)ζ渌虻幕顒?dòng)起調(diào)控作用( 如調(diào)節(jié)基因、啟動(dòng)基因、操縱基因)。,例如：在一個(gè)基因區(qū)域內(nèi)，仍可以劃分出若干起作用的小單位。,. 現(xiàn)代遺傳學(xué)上認(rèn)為：,重組子：在性狀重組時(shí)，可交換的最小單位稱為重組子。一個(gè)交換子

18、只包含一個(gè)堿基對(duì)。,順反子：表示一個(gè)作用的單位，基本上符合通常所述基因的大小或略小。所包括的一段DNA與一個(gè)多肽鏈的合成相對(duì)應(yīng)；平均大小為5001500個(gè)堿基對(duì)。,基因概念：,基因：相當(dāng)于一個(gè)順反子， 包含許多突變子和 重組子。,紫外燈下的DNA,分子遺傳學(xué)保留了功能單位的解釋，而拋棄了最小結(jié)構(gòu)單位說(shuō)法。,、分子遺傳學(xué)對(duì)基因概念的新發(fā)展,將基因分為不同類型：,調(diào)控基因(regulator gene)：,指其表達(dá)產(chǎn)物參與調(diào)控其它基因表達(dá)的基因。,5.3.2側(cè)翼序列與調(diào)控序列,側(cè)翼序列：是指結(jié)構(gòu)基因第一和最后一個(gè)外顯子外側(cè)的非編碼序列，常對(duì)基因的表達(dá)起調(diào)控作用。,5.3.2.1啟動(dòng)子：是位于結(jié)構(gòu)基

19、因5，端上游的一段DNA序列，能夠指導(dǎo)全酶(holoenzyme)同模板正確結(jié)合，活化RNA聚合酶，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。 各種原核基因有一個(gè)由5個(gè)核苷酸(TATAA)組成的共同序列，以其發(fā)現(xiàn)者的名字命名為Pribnow框(Pribnowbox)，這個(gè)框的中央位于起點(diǎn)上游10bp處，所以又稱10序列(10 sequence)，后來(lái)在35 bp處又找到另一個(gè)共同序列(TTGACA)。,Hogness等在真核基因中又發(fā)現(xiàn)了類似Pribnow框的共同序列，即位于2530 bp處的TATAAAAG，也稱TATA框(TATAbox)。TATA框上游的保守序列稱為上游啟動(dòng)子元件(UPE)或上游激活序列(UAS)。

20、另外在7078 bp處還有一段共同序列CCAAT，稱為CAAT框(CAAT box)。 在真核基因中，有少數(shù)基因沒有TATA框。沒有TATA框的真核基因啟動(dòng)子序列中，有的富集GC，即有GC框；有的則沒有GC框。GC框位于80110bp處的GCCACACCC或GGGCGGG序列。,5.3.2.2增強(qiáng)子,增強(qiáng)子（enhomcer）較常見的是遠(yuǎn)端調(diào)控區(qū)。至少在有時(shí)候增強(qiáng)子的存在可以增強(qiáng)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。它是在1981年由Benerji,Rusconi小組和Chambom等發(fā)現(xiàn)的，又稱遠(yuǎn)上游序列（far upstream seguence）。其特點(diǎn)是： 具有遠(yuǎn)距離效應(yīng)。常在上游-200bp處，但可增強(qiáng)

21、遠(yuǎn)處啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，即使相距十幾Kb也能發(fā)揮其作用； 無(wú)方向性。無(wú)論在靶基因的上游，下游或內(nèi)部都可發(fā)揮增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的作用； 順式調(diào)節(jié)。只調(diào)節(jié)位于同一染色體體上的靶基因，而對(duì)其它染色體上的基因無(wú)作用； 無(wú)物種和基因的特異性，可以接到異源基因上發(fā)揮作用，如將SV40的增強(qiáng)子接到兔-珠蛋白基因前，引入Lela細(xì)胞，此珠蛋白基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)200倍。 具有組織的特異性。 SV40的增強(qiáng)子在3T3細(xì)胞中比多瘤病毒的增強(qiáng)子要弱，但在Hela細(xì)胞中SV40的增強(qiáng)子比多瘤病毒的要強(qiáng)5倍，抗體基因的增強(qiáng)子只有在B淋巴細(xì)胞中才起作用。增強(qiáng)子的效應(yīng)需特定的蛋白質(zhì)因子參與。 有相位性。其作用和DNA的構(gòu)象有關(guān)。 有的增強(qiáng)子可以

22、對(duì)外部信號(hào)產(chǎn)生反應(yīng)。如熱體克基因在高溫下才表達(dá)。編碼重金屬蛋白的金屬硫蛋白基因在鎘和鋅存在下才表達(dá)。某些增強(qiáng)子可以被固醇類激素所激活。,5.3.2.3終止子,原核生物轉(zhuǎn)錄的終止處有特殊結(jié)構(gòu)的存在，稱為終止子（terminator,t）RNA Pol能識(shí)別t位點(diǎn)在此處停止，然后釋放RNA，最終RNA聚合酶也脫離模板，終止了轉(zhuǎn)錄。 在原核細(xì)胞中有兩種不同的終止子，一種是強(qiáng)終止子，另一種是弱終止子。強(qiáng)終止子在體外實(shí)驗(yàn)中，無(wú)需其他任何因子的幫助就可以終止核心酶，這種終止子被稱為內(nèi)部終止子（intrinsic terminators）。弱終止子需要在一種蛋白質(zhì)因子（rho factor）的幫助一才能終止

23、，所以又稱為依賴性終止子（Rho-dependent terminator）。,圖10-11弱終止子的結(jié)構(gòu),5.3.2.4絕緣子,絕緣子(insulator)長(zhǎng)約幾百個(gè)核苷酸對(duì)，是通常位于啟動(dòng)子同正調(diào)控元件(增強(qiáng)子)或負(fù)調(diào)控因子(為異染色質(zhì))之間的一種調(diào)控序列。絕緣子本身對(duì)基因的表達(dá)既沒有正效應(yīng)，也沒有負(fù)效應(yīng)，其作用只是不讓其他調(diào)控元件對(duì)基因的活化效應(yīng)或失活效應(yīng)發(fā)生作用。 由于有些增強(qiáng)子位于啟動(dòng)子上游，有些位于下游，所以絕緣子的效應(yīng)并不取決于絕緣子同啟動(dòng)子的相對(duì)位置。因此，對(duì)絕緣子效應(yīng)的方向性的原因還沒有真正弄清楚。,5.3.3 重疊基因(overlapping gene),指在同一段DNA順

24、序上，由于閱讀框架不同或終止 早晚不同，同時(shí)編碼兩個(gè)以上基因的現(xiàn)象。,A,B,C,D,F,5.4 DNA與蛋白質(zhì),5.4.1蛋白質(zhì)是氨基酸的線性多聚體,蛋白質(zhì)是具有特定構(gòu)象的大分子，為研究方便，將蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分為四個(gè)結(jié)構(gòu)水平，包括一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu)。一般將二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu)稱為三維構(gòu)象或高級(jí)結(jié)構(gòu)。 一級(jí)結(jié)構(gòu)指蛋白質(zhì)多肽鏈中氨基酸的排列順序。肽鍵是蛋白質(zhì)中氨基酸之間的主要連接方式，即由一個(gè)氨基酸的-氨基和另一個(gè)氨基酸的-羧基之間脫去一分子水相互連接。肽鍵具有部分雙鍵的性質(zhì)，所以整個(gè)肽單位是一個(gè)剛性的平面結(jié)構(gòu)。在多肽鏈的含有游離氨基的一端稱為肽鏈的氨基端或N端，而另一端

25、含有一個(gè)游離羧基的一端稱為肽鏈的羧基端或C端。,5.4.2通過(guò)轉(zhuǎn)錄將DNA的遺傳信息傳給RNA,一. RNA合成的基本特點(diǎn) 1960年Weiss,S,B等發(fā)現(xiàn)RNA聚合酶（RNA Pol）。 其特點(diǎn)是： （1）以核糖核苷三磷酸（rNTR）為底物； （2）以DNA為模板； （3）按5-3方向合成； （4）無(wú)需引物的存在能單獨(dú)起始鏈的合成； （5）第一個(gè)引入的rNTP是以三磷酸形式存在； （6）在體內(nèi)DNA雙鏈中僅一條鏈作為模板； （7）RNA的序列和模板是互補(bǔ)的。,二、轉(zhuǎn)錄作用及其特點(diǎn) 轉(zhuǎn)錄作用是DNA指導(dǎo)的RNA合成作用。反應(yīng)是以DNA為模板，在RNA聚合酶催化下，以四種三磷酸核苷（NTP）即

26、ATP、GTP、CTP及UTP為原料，各種核苷酸之間的3、5磷酸二酯鍵相連進(jìn)行的聚合反應(yīng)。合成反應(yīng)的方向?yàn)?3。反應(yīng)體系中還有Mg2+、Mn2+等參與，反應(yīng)中不需要引物參與。堿基互補(bǔ)原則為A-U、G-C，在RNA中U替代T與A配對(duì)。,確定有義鏈,現(xiàn)在將作為轉(zhuǎn)錄模板的DNA單鏈稱為模板鏈或反義鏈（antisen strand）， 非模板鏈稱為有義鏈（sense strand）或編碼鏈。 在體外DNA的兩條鏈都可作為RNA合成的模板。,怎樣用實(shí)驗(yàn)證實(shí)mRNA的合成總是延著5-3方向進(jìn)行的？ E.coli在 0C時(shí)需13秒鐘才能加上一個(gè)核苷酸，但在37C每秒就可加上40個(gè)核苷酸; 利用這個(gè)差別以14

27、C來(lái)標(biāo)記U,在0C培養(yǎng)E.coli，。 提取這種正在伸長(zhǎng)的mRNA分子 發(fā)現(xiàn)14C標(biāo)記首先出現(xiàn)在伸長(zhǎng)的3端，因此可以證明合成是延著5-3方向進(jìn)行的。,RNA合成和DNA復(fù)制的區(qū)別,（1）轉(zhuǎn)錄時(shí)只有一條DNA鏈為模板，而復(fù)制 時(shí)兩條鏈都可作為模板； （2）DNA-RNA雜合雙鏈不穩(wěn)定，RNA合成后釋放，而DNA復(fù)制叉形成后一直打開，新鏈和鏈母成子鏈； （3）RNA合成不需引物，而DNA復(fù)制需引物； （4) 轉(zhuǎn)錄的底物是rNTP，復(fù)制的底物是dNTP； （5）聚合酶系不同。,原核生物的基因轉(zhuǎn)錄,一細(xì)菌的RNA聚合酶 RNA pol和DNA pol也有2點(diǎn)不同： （1）RNA pol沒有任何校對(duì)功能

28、； （2）能起始新的RNA鏈。,原核生物轉(zhuǎn)錄的起始延伸,(一) 啟動(dòng)子（promoter）的結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄起始 (1)結(jié)構(gòu)典型,都含識(shí)別（R),結(jié)合（B)和起始 （I）位點(diǎn); (2)序列保守; (3)位置和距離都比較恒定； (4)直接和多聚酶相結(jié)合； (5)常和操縱子相鄰； (6)位于基因的5端； (7)決定轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)和方向。 (8)特殊的操縱子的R,B序列不同。,E.coli中不同的因子 可識(shí)別不同的啟動(dòng)子,典型啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu),-35 -10 轉(zhuǎn)錄起點(diǎn) TTGACA 16-19bp TATAAT 5-9bp,-10序列對(duì)轉(zhuǎn)錄的效率影響,TATAATAATAAT，轉(zhuǎn)錄效率下降,稱為下降突變（down

29、 mutation）。 TATGTTTATATT，轉(zhuǎn)錄效率上升，為上升突變（up mutation）。 以上突變?yōu)楹螘?huì)影響轉(zhuǎn)錄效率？ 前者可能由于T-A的堆集能要小于A-T的堆積能，后者可能是由于堆集能降低和氫鍵的減少，,2. -35序列,-35序列又稱為Sextama盒（Sextama box）， 其保守序列為（T82T84G78A65C54A45） 其功能是: (1) 為RNA pol的識(shí)別位點(diǎn)。 亞基識(shí)別-35序列，為轉(zhuǎn)錄選擇模板 (2)-35和-10序列的距離是穩(wěn)定的，此與RNA pol的結(jié)構(gòu)有關(guān)。,3. 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（I）。,轉(zhuǎn)錄開始時(shí)模板上的第一個(gè)堿基 在原核中常為A或G 而且位置

30、固定,轉(zhuǎn)錄的起始,1.全酶與模板的DNA接觸，生成非專 一的,不穩(wěn)定的復(fù)合物在模板上移動(dòng)； 2. 起始識(shí)別：全酶與35序列結(jié)合， 產(chǎn)生封閉的酶-啟動(dòng)子二元復(fù)合物 （closed binary complex）； 3.全酶緊密地結(jié)合在-10序列處，模板 DNA局部變性，形成開放的啟動(dòng)子二 元復(fù)合體； 4. 酶移動(dòng)到I，第一個(gè)rNTP轉(zhuǎn)錄開始, 因子釋放,形成酶-啟動(dòng)子-rNTP三元復(fù) 合體（ternary complex）。,RNA核心酶和全酶在DNA上的分布:,(1) 和1/3的RNA pol結(jié)合成全酶，或在非特異位點(diǎn)的松散復(fù)合體中，或在啟動(dòng)子中的二元復(fù)合體中； (2) 其中半數(shù)的核心酶從事轉(zhuǎn)

31、錄； (3) 余下的核心酶大量存在于閉合松散復(fù)合體中； (4)估計(jì)數(shù)量很少的全酶是游離的。,三 原核生物轉(zhuǎn)錄的終止,終止子（terminator,t） 強(qiáng)終止子內(nèi)部終止子（intrinsic terminators）。 弱終止子 需要因子（rho factor） 又稱為依賴性終止子 （Rho-dependent terminator）,強(qiáng)終止子的結(jié)構(gòu),NNAAGCGCCGNNNCCGGCGCTTTTTTNNN NNTTCGCGGCNNNGGCCGCGAAAAAANNN DNA NNAAGCGCCGNNNCCGGCGCUUUUUUNNN RNA,N N N N N G C C G C G G C

32、 C G G C C U NNNNC U UUUU-OH 3 強(qiáng)終止子結(jié)構(gòu)的模式圖,強(qiáng)終止子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),(1) 有回文結(jié)構(gòu)存在； （2）莖的區(qū)域富內(nèi)含G-C； (3) 強(qiáng)終止子3端上有6個(gè)U； 以上結(jié)構(gòu)特點(diǎn)在終止中起何作用？,RNA Pol轉(zhuǎn)錄DNA 因子附著到RNA 識(shí)別位點(diǎn)上 因子跟在RNAPol 后沿RNA移動(dòng) RNA Pol在終止位 點(diǎn)停下，并被因 子追上 在轉(zhuǎn)錄泡中因子 使DNA-RNA雜種雙 鏈解開 轉(zhuǎn)錄終止,釋放出 RNA Pol,子 和 RNA,野生型 突變型 核糖體結(jié)合到mRNA上 核糖體阻礙 核糖體在突 了因子的 變位點(diǎn)解離 附著和移動(dòng) 因子附著 因子和核 核糖體阻礙 核糖

33、體接觸 因子移動(dòng) 轉(zhuǎn)錄繼續(xù) 轉(zhuǎn)錄提前 終止,真核生物的轉(zhuǎn)錄,真核生物的轉(zhuǎn)錄和原核轉(zhuǎn)錄的不同點(diǎn)： (1) 原核只有一種RNA聚合酶，而真核細(xì) 胞有三種聚合酶； (2) 啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)不同，真核有三種 不同的啟動(dòng)子和有關(guān)的元件； (3) 真核的轉(zhuǎn)錄有很多蛋白質(zhì)因子的介入。,真核的RNA聚合酶,表12-2 真核生物的三種RNA聚合酶的特點(diǎn) RNA Pol位置 產(chǎn)物 相對(duì)活性 對(duì)-鵝膏蕈的敏 Pol 核仁28s,18s,5.8s rRNAs 5070% 不敏感 Pol 核質(zhì)hnRNA,mRNA,某些SnRNA 2040% 高度敏感 Pol 核質(zhì)tRNA,5SrRNA,某些SnRNAs 10% 片段特

34、異，中等敏感 表12-3 轉(zhuǎn)錄的抑制劑 抑制劑 靶酶 抑制作用 利福霉素細(xì)菌全酶和亞基結(jié)合，抑制起始 鏈霉溶菌素細(xì)菌核心酶和亞基結(jié)合，抑制起始 放射線素D真核Pol和DNA結(jié)合，阻止延伸 -鵝膏蕈真核Pol和RNA Pol結(jié)合,B220240Kda與模板結(jié)合，與鏈的起始，延伸有關(guān)，相 當(dāng)于原核 RNA Pol的亞基C端含有羧基末端功能區(qū) 大亞基 B140150Kda與DNA、底物和新生的RNA結(jié)合，相當(dāng)于原核RNA Pol B44.5酶的連接，相當(dāng)于原核RNA的亞基 RNA Pol ABC 27KDa 磷酸化蛋白， 1類三種RNA Pol共有，如 ABC 25.5KDa 與DNA結(jié)合有關(guān) AB

35、C 23KDa B 12.6 小亞基 2類Pol 特有 B 23 B 14.5 B 10 3類在某些條件下可除去的亞基 B 23參與酶的基本結(jié)構(gòu) B 16.5 細(xì)胞器的RNA Pol和噬菌體的RNA相似，因有單一固定的功能，分子量較小 表12-3 真核生物聚合酶的成分及功能,二真核生物的啟動(dòng)子,啟動(dòng)子最為復(fù)雜，它和原核的啟動(dòng)子有很多不同： （1）有多種元件：TATA框，GC框，CATT框，OCT等； （2）結(jié)構(gòu)不恒定； （3）它們的位置、序列、距離和方向都不完全相同； （4）有的有遠(yuǎn)距離的調(diào)控元件存在，如增強(qiáng)子； （5）這些元件常常起到控制轉(zhuǎn)錄效率和選擇起始位點(diǎn)的作 （6）不直接和RNA po

36、l結(jié)合； (7) 需多種轉(zhuǎn)錄因子介入。,真核啟動(dòng)子含有不同的組件,SV40 早期啟動(dòng)子 胸苷激酶 組蛋白H2B -140 -120 -100 -80 -60 -40 -20 +1 Oct CAAT GC TATA,(一)類基因的啟動(dòng)子和調(diào)控區(qū),TATA框 核心元件 啟始子（initiator，Inr）:一般由PY2CAPY5構(gòu)成， 位于-3+5 ，可能提供RNA pol 識(shí)別。 CAAT box、 類啟動(dòng)子 上游元件組成 GC box Oct 增強(qiáng)子（enhomcer） 遠(yuǎn)端調(diào)控區(qū) 減弱子（dehancer） 靜息子（sisencer） 上游激活序列（upstream activating s

37、eguences UASs）,起始子,起始點(diǎn)一般沒有同源序列 mRNA的第一個(gè)堿基傾向A，另一側(cè)翼由Py組成稱為起始子（initiator,Inr).（在原核CAT起始序列也有這種情況）。 一般由PY2CAPY5構(gòu)成 位于-3+5 提供RNA pol 識(shí)別。 無(wú)論TATA是否存在，Inr對(duì)啟動(dòng)子的強(qiáng)度和起始位點(diǎn)的選擇都是重要的 。 現(xiàn)已純化了Inr 結(jié)合蛋白。,核心元件,TATA框合又稱Hogness框，Goldberg-Hogness 框，俚語(yǔ) 稱為金磚（Goldbrick） 其一致序列是：T85A97T93A85A63A83A50 常在-25左右，相當(dāng)于原核的-10序列。 其作用是： (1

38、) 選擇正確的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，保證精確起始， 故也稱為選擇子（selector）。 (2) 影響轉(zhuǎn)錄的速率。,.上游啟動(dòng)子元件（UPE）,表12-4 哺乳動(dòng)物RNA Pol 上游轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的元 元件保守序列結(jié)合DNA的長(zhǎng)度 蛋白質(zhì)因子 TATAboxTATAAAA 10bp TBP CAAT boxGGCCAATCT 22bp CTF/NF1 GC boxGGGCGG 20bp SP1 OctamerATTTGCAT 20bp Oct-1 OctamerATTTGCAT 23bp Oct-2 KB GGGACTTTCC 10bp NFKB ATF GTGACGT 20bp ATF B. Lew

39、in:GENES.1997,Table 28.2,增強(qiáng)子,它是在1981年由Benerji,Rusconi小組和Chambom等發(fā)現(xiàn)的，又稱遠(yuǎn)上游序列 （far upstream seguence）。 其特點(diǎn)是： 具有遠(yuǎn)距離效應(yīng)。 無(wú)方向性。 順式調(diào)節(jié)。 無(wú)物種和基因的特異性。 具有組織的特異性。 有相位性。其作用和DNA的構(gòu)象有關(guān)。 有的增強(qiáng)子可以對(duì)外部信號(hào)產(chǎn)生反應(yīng)。,增強(qiáng)子為什么具有遠(yuǎn)距離作用呢？ （1）拓樸效應(yīng)；拓樸效應(yīng)說(shuō)認(rèn)為增強(qiáng)子的 作用是誘導(dǎo)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，使核小 體產(chǎn)生DNaseI敏感區(qū)。 （2）滑動(dòng)模型； （3）成環(huán)模型。 Enhancer Promotor,(三) RNA po

40、l啟動(dòng)子,核心啟動(dòng)子（core promoter）或核心元件（core element），位于-45到+20，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄的起始。 上游控制元件（upstream,control element UCE），從-180延伸到-107， 可增加核心元件的轉(zhuǎn)錄起始的效率。,1701601501401301201106050403020 10 1 1020 上游控制區(qū) 核心啟動(dòng)子 UBF1 UBF1結(jié)合于GC 豐富區(qū) SL1 SL1與UBF1協(xié)同結(jié)合 TFB Pol 1 ?,1 型內(nèi)部啟動(dòng)子 2 型內(nèi)部啟動(dòng)子 轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn) 轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn) boxA boxC boxA boxB TFIIIA TFIII C T

41、FIII C TFIII B TBP A B TFIII C TFIII B Plo III Pol III,TBP Pol III 啟 動(dòng) 子 TFIIIB TFIIIC TBP RNA Pol III Pol I 啟 動(dòng) 子 SL1 RNA Pol I TBP UBF1 Pol II 啟 動(dòng) 子 TFIID TATA 轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn) RNA Pol II,轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn) OSE PSE TATA OCT-1 PBP TFD OSE (OCT sequuence element) TFB PSE(prixima sequuence element) RNA pol ,轉(zhuǎn)錄后加工,轉(zhuǎn)錄后的加工（pos

42、ttranscriptional modification） （1）減少部分片段：如切除5端前導(dǎo)序列， 3端拖尾序列和中部的內(nèi)含子； （2）增加部分片段：5加帽，3加poly(A), 歸巢和通過(guò)編輯加入一些堿基；（戴帽子，加尾巴） （3）修飾：對(duì)某些堿基進(jìn)行甲基化等。,tRNA和rRNA的加工,一. 原核的 tRNA和 rRNA的加工 參與蛋白質(zhì)合成的tRNA和rRNA都不是最初的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 (1) 它們的5端都是單磷酸，而原始的轉(zhuǎn) 錄產(chǎn)物5應(yīng)是三磷酸； (2) 分子比初始轉(zhuǎn)錄物??； (3) tRNA含有特殊的堿基，這些堿基只有通過(guò)一些化學(xué)修飾才可以得到。,tRNA的加工,tRNA的加工分成3個(gè)

43、階段 (1) “斬頭”，形成5末端； (2) 去尾，形成3-OH末端。缺-CCA的 tRNA要用tRNA核酸轉(zhuǎn)移酶加-CCA。 (3)修飾：通過(guò)甲基化酶，硫醇酶，假尿嘧啶核苷化酶等進(jìn)行修飾，如氨基酸臂的4-硫尿苷（4tu），D臂的2甲基鳥苷（2mG），TC臂的假尿苷（）和反密碼子環(huán)上的2異戊腺苷（2ipA),真核tRNA內(nèi)含子的特點(diǎn)：,位置相同，都在反密碼子環(huán)的下游； 不同tRNA的內(nèi)含子長(zhǎng)度和序列各異； 外顯子和內(nèi)含子交界處無(wú)保守序列； 內(nèi)含子的剪切是依靠RNase異體催化； 內(nèi)含子和反密碼子配對(duì)形成莖環(huán)。 有何意義？,二 真核的tRNA和rRNA的加工,真核tRNA的基因和原核不同： (1

44、)真核的前體分子tRNA是單順反子，但成 簇排列，基因間有間隔區(qū)； (2)真核tRNA基因一般都比原核tRNA基因多 得多，如酵母約有400個(gè)tRNA基因； (3) 5端單磷酸核苷酸，表明已被加工過(guò)； (4) tRNA的前體分子中含有內(nèi)含子。,真核tRNA內(nèi)含子切除的特點(diǎn)：,(1)沒有交界序列，也沒有內(nèi)部引導(dǎo)序列； (2)剪切反應(yīng)的信號(hào)是二級(jí)結(jié)構(gòu)，而不是 一 級(jí)結(jié)構(gòu)； (3)是依賴于蛋白質(zhì)性的RNase，而不是核 糖擬酶或snRNP； (4)反應(yīng)的本質(zhì)不是轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。,真核tRNA的加工和原核的區(qū)別,(1)真核tRNA前體中無(wú)二聚體和多聚體； (2)增加了剪接內(nèi)含子的過(guò)程； (3)都要加CCA。,真核細(xì)胞中rRNA的加工途徑,(1) 切除5端的前導(dǎo)序列； (2) 從41S的中間產(chǎn)物中先切下18S的片段。 Hela細(xì)胞的切點(diǎn)在18S和5.8S之間的ITS（內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔序列）； L細(xì)胞的切點(diǎn)在