部分、肉毒梭菌、副溶血性弧菌、蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn).ppt

1、第四節(jié)、肉毒梭狀芽孢桿菌檢驗(yàn),一、肉毒梭狀芽孢桿菌的生物學(xué)特性 1、形態(tài)與染色 肉毒梭菌屬于厭氧性梭狀芽胞桿菌屬，革蘭氏染色陽性，約為41m的大桿菌， 多單在，偶見成雙或短鏈，兩側(cè)平行，兩端鈍園，直桿狀或稍彎曲，芽胞為卵圓形，大于菌體寬度，位于次極端，使菌體呈匙形或網(wǎng)球拍狀，偶有位于中央，常見很多游離芽胞。 有48根周生鞭毛，運(yùn)動遲緩，無莢膜。,2、培養(yǎng)特性,最嚴(yán)格的厭氧菌 生長最適溫度：28 37 ：pH為6.87.6，產(chǎn)毒的最適pH為7.8 8.2。 產(chǎn)毒培養(yǎng)溫度：不同菌型產(chǎn)毒的最適培養(yǎng)溫度不完全相同。C、D型溫度高些為宜，35 培養(yǎng)3d即可，而E型菌低溫度長時間培養(yǎng)效果較好。 對營養(yǎng)要求

2、不高 ：在普通培養(yǎng)基上都能生長。,肉毒梭狀芽孢桿菌菌落,在固體培養(yǎng)基表面上，形成類圓形，邊緣不整齊，約3毫米左右的菌落。菌落半透明，表面一般比較光滑也有的呈顆粒狀，界線不明顯，向外擴(kuò)散。呈絨毛網(wǎng)狀，常常擴(kuò)散成菌苔。,肉毒梭菌的生化性狀很不規(guī)律，即使同型，也常見到株間的差異。,3、肉毒梭菌的生化特性,表1 各型肉毒梭菌的生化反應(yīng),二、肉毒梭菌的致病性,肉毒梭菌能產(chǎn)生外毒素即肉毒毒素（大分子蛋白），根據(jù)毒素的抗原特異性將其分為A、B、C （1、2） 、D、E、F、G七個型別。與毒素型別相對應(yīng)，肉毒梭菌也分為同樣的七個型別。其中A、B、E、F四型毒素對人有不同程度的致病性。 A型毒素經(jīng)602分鐘加熱

3、，差不多能被完全破壞，而B、E二型毒素要經(jīng)702分鐘才能被破壞；C、D二型毒素對熱的抵抗更大些；C型毒素要經(jīng)過902分鐘加熱才能完全破壞，不論如何，只要煮沸1分鐘或75加熱510分鐘，毒素都能被完全破壞。肉毒毒素對酸性反應(yīng)比較穩(wěn)定，對堿性反應(yīng)比較敏感。某些型的肉毒毒素在適宜條件下，毒性能被胰酶激活和加強(qiáng)。,肉毒毒素是一種神經(jīng)麻痹毒素，主要抑制神經(jīng)末梢釋放乙酰膽堿，引起肌肉松弛麻痹，特別是呼吸肌麻痹導(dǎo)致死亡。 肉毒毒素的毒性極強(qiáng)，是目前已知在天然毒素和合成毒劑中毒性最強(qiáng)的生物毒素，據(jù)稱，精制毒素1克能殺死400萬噸小白鼠，一個人的致死量大概1微克左右。 肉毒中毒一年四季均可發(fā)生。美國以罐頭發(fā)生中

4、毒較多，日本以水產(chǎn)品較多；我國以發(fā)酵食品（如：臭豆腐、豆瓣醬、豆豉等）發(fā)生中毒較多。,三、檢驗(yàn)方法,1、檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)：GB 4789.12-2003 2、培養(yǎng)基和試劑 培養(yǎng)基： 庖肉培養(yǎng)基、卵黃瓊脂培養(yǎng)基、明膠磷酸鹽緩沖液。 試劑： 肉毒分型抗毒診斷血清、胰酶（活力1:250）、革蘭氏染色液。 另需實(shí)驗(yàn)動物（小白鼠）。,3、檢驗(yàn)程序,檢 樣,毒素檢測,增菌、產(chǎn)毒培養(yǎng) 30，5 d,報告 （一）,毒素檢測,報告（二）,分離培養(yǎng),培養(yǎng)檢查,毒素檢測,報告（三）,增菌產(chǎn)毒培養(yǎng) 30，5 d,觀察生長性狀， 染色鏡檢,觀察菌落性狀 染色鏡檢,報告(一)：檢樣中有無肉毒毒素以及有何型肉毒毒素。(如僅為了肉毒

5、中毒診斷，即可結(jié)束檢驗(yàn)) 報告(二)：對增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)物，一方面做生長特性觀察，同時檢測肉毒毒素。報告檢樣中有無肉毒梭菌以及有何型肉毒梭菌。（有些樣品如土壤、泥沙等基本上不可能含有毒素，則應(yīng)從培養(yǎng)著手） 報告(三)：欲獲純菌株，可用增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)物進(jìn)行分離培養(yǎng)，對所得純菌株進(jìn)行形態(tài)、培養(yǎng)特性等觀察及毒素檢測，其結(jié)果可證明所得純菌為何型肉毒梭菌。（一般情況下，沒有必要從檢樣中分離純的菌株，但研究或特殊需要例外）,（1）、肉毒毒素檢測,注射液中若有肉毒毒素存在，小白鼠一般多在注射后24 h內(nèi)發(fā)病、死亡。,液態(tài)或固體樣品經(jīng)過適當(dāng)處理后離心，取上清液實(shí)驗(yàn),上清液及其胰酶激活處理液,分別進(jìn)行小白鼠腹腔注射，

6、各3只，每只0.5 mL，觀察4 d,確證試驗(yàn),毒力測定,定型試驗(yàn),取庖肉培養(yǎng)基五支，煮沸10min15min，做如下處理： 第一支：急速冷卻，接種檢樣均質(zhì)液1 mL2 mL； 第二支：冷卻至60，接種檢樣，繼續(xù)于60保溫10 min，急速冷卻； 第三支：接種檢樣，繼續(xù)煮沸加熱10 min，急速冷卻。 第四支：急速冷卻，接種肉毒梭菌菌種。 第五支：急速冷卻，作為空白對照。 以上5支試管于30厭氧培養(yǎng)5d，若無生長，可再培養(yǎng)10d。培養(yǎng)到期，若有生長，取培養(yǎng)液離心，以其上清液進(jìn)行毒素檢測試驗(yàn)，方法同上，陽性結(jié)果證明檢樣中有肉毒梭菌存在。,（2）、肉毒梭菌的檢出（增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)試驗(yàn)）,選取證實(shí)含有肉

7、毒毒素的增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)物（必要時可重復(fù)一次適宜的加熱處理）接種卵黃瓊脂平板，35厭氧培養(yǎng)48 h。肉毒梭菌在卵黃瓊脂平板上生長時，菌落及周圍培養(yǎng)基表面覆蓋著特有的虹彩樣(或珍珠層樣)薄層，但G型菌無此現(xiàn)象。 根據(jù)菌落形態(tài)及菌體形態(tài)挑取可疑菌落，接種庖肉培養(yǎng)基，于30培養(yǎng)5d，進(jìn)行毒素檢測及培養(yǎng)特性檢查確證試驗(yàn)。,（3）、分離培養(yǎng),（1）毒素檢測：試驗(yàn)方法同上。（2）培養(yǎng)特性檢查：接種卵黃瓊脂平板，分成兩份，分別在35的需氧和厭氧條件下培養(yǎng)48 h，觀察生長情況及菌落形態(tài)。肉毒梭菌只在厭氧條件下生長而在需氧條件下不生長。,4、結(jié)果報告,報告(一)：檢樣含有某型肉毒毒素。報告(二)：檢樣含有某型肉毒

8、梭菌。報告(三)：由樣品分離的菌株為某型肉毒梭菌。 肉毒梭菌檢驗(yàn)?zāi)繕?biāo)主要是毒素，不論食品中的肉毒毒素檢驗(yàn)還是肉毒梭菌檢驗(yàn)，均以毒素的檢測及定型試驗(yàn)為判定的主要依據(jù)。,第五節(jié)、副溶血性弧菌檢驗(yàn),一、生物學(xué)特性 1、形態(tài)與染色 革蘭氏陰性無芽胞多形態(tài)桿菌或稍彎曲弧菌 ，有時呈棒狀、甚至球狀、絲狀等。單端鞭毛。無芽胞、無莢膜。,2、培養(yǎng)特性,需氧或兼性厭氧 嗜鹽，在2%NaCL培養(yǎng)基中生長最好，無鹽或食鹽10%不能生長。 最適溫度36，pH7.57.8 在固體培養(yǎng)基上菌落呈圓形凸起，混濁不透明，表面光滑，較濕潤，邊緣不整齊。 在血平板上可見溶血環(huán)。,3、生化特性,分解葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不分解乳糖，蔗

9、糖。 H2S（）、V-P（）、靛基質(zhì)（+）、精氨酸（） 甲基紅（+）、賴氨酸（）、溶血/-,O抗原：O1O13 13種。 H抗原： K抗原：K1K71 65種。 （ 缺編：K2 、 K14 、K17、 K35、 K62） 血清分型：所有副溶血性弧菌的H 抗原均相同，但是O 抗原和K 抗原存在差異，以13種O抗原及65種K抗原將其分為13個群和845個型。,4、抗原結(jié)構(gòu),二、致病性,1、致病因素 侵襲力：活菌(105107/g)，可使人致病 . 產(chǎn)生溶血毒素：耐熱性溶血毒素(THD)和耐熱性溶血毒素相關(guān)的溶血毒素(TRH)，此外有的可產(chǎn)生不耐熱溶血毒素(TLH)。,2、媒介食品 主要是海產(chǎn)品（魚

10、、蝦、蟹、蛤等），含鹽量較高的食物亦可帶菌。 3、所致疾病 食物中毒、急性胃腸炎、敗血癥等。,1、檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)：GB/T 4789.7-2008 副溶血性弧菌檢驗(yàn) 2、培養(yǎng)基和試劑 培養(yǎng)基：3氯化鈉堿性蛋白陳水APW) 、 硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖（TCBS）瓊脂 3氯化鈉胰蛋白胨大豆TSA）瓊脂 3氯化鈉三糖鐵（TSI）瓊脂 嗜鹽性試驗(yàn)培養(yǎng)基 3氯化鈉甘露醇試驗(yàn)培養(yǎng)基 3氯化鈉賴氨酸脫狡酶試驗(yàn)培養(yǎng)基 3氯化鈉MR-VP培養(yǎng)基 我妻氏血瓊脂、弧菌顯色培養(yǎng)基 試劑：氧化酶試劑、革蘭氏染色液、ONPG試劑、3%氯化鈉溶液、 V-P試劑、API20E生化鑒定試劑盒等。,三、檢驗(yàn)方法,3、檢驗(yàn)程序

11、,（1）樣品處理及培養(yǎng) 定量測定：樣品用3%氯化鈉蛋白胨水 10倍連續(xù)稀釋后取三個稀釋度各接3支含有該培養(yǎng)基的試管，培養(yǎng)。 定性檢測：用上述1:10稀釋液增菌培養(yǎng)。 （2）分離：有菌生長的試管分別接種TCBS平板或弧菌顯色培養(yǎng)基平板上劃線分離、培養(yǎng)。 （3）純培養(yǎng)：挑可疑菌落劃線分離。 （4）初步鑒定：生化實(shí)驗(yàn)和鏡檢鑒定。 （5）確定鑒定：生化試驗(yàn)鑒定。 （6）報告 定性檢測或定量檢測。 （7）血清學(xué)分型：（選做） （8）神奈川試驗(yàn)：,分離：在所有顯示生長的試管或增菌液中用接種環(huán)沾取一環(huán)，劃線分離。 副溶血性弧菌在TCBS瓊脂平板上的典型菌落： 圓形、半透明、表而光滑、質(zhì)感類似口香糖、直徑2m

12、m3mm的綠色菌落。（培養(yǎng)基中含溴麝香草酚蘭和H2S指示劑 ，因副溶血性弧菌不分解蔗糖、不產(chǎn)H2S，為綠色菌落）,副溶血性弧菌,混合菌種,副溶血性弧菌在弧菌顯色培養(yǎng)基上典型菌落特征： 呈圓形、半透明、表面光滑的粉紫色菌落，直徑2mm3mm。,初步鑒定：,挑取純培養(yǎng)的單個可疑菌落，進(jìn)行副溶血性弧菌的初步鑒定：,副溶血性弧菌： 氧化酶試驗(yàn)：陽性。 涂片鏡檢：G-，棒狀、弧狀、卵圓狀等多形態(tài)，無芽胞，有鞭毛。 3氯化鈉三糖鐵斜面 ：底層變黃不變黑，無氣泡，斜面顏色不變或紅色加深，有動力。 嗜鹽性試驗(yàn)：分別接種于不同氯化鈉濃度的胰胨水中培養(yǎng)，在無氯化鈉和10氯化鈉的胰胨水中不生長或微弱生長，在7氯化鈉

13、的胰胨水中生長旺盛。,生化試驗(yàn)：分別接種各類生化培養(yǎng)基，培養(yǎng)后觀察結(jié)果。 或API20E生化鑒定試劑盒或VITEK全自動微生物檢測系統(tǒng)鑒定。 生化性狀符合下表要求時，為副溶血性弧菌 。,確定鑒定:,表 副溶血性弧菌的生化性狀,定性檢測：報告25g（ml）樣品中是否檢出副溶血性弧菌。 定量檢測：根據(jù)證實(shí)為副溶血性弧菌陽性的試管管數(shù)，查MPN檢索表，報告每克（毫升）副溶血性弧菌的MPN值。,報告：,神奈川試驗(yàn)：,測試副溶血性弧菌分離株是否存在特定溶血素（與致病性顯著相關(guān)）。將測試菌點(diǎn)種在我妻氏血瓊脂平板上，培養(yǎng)后觀察是否有溶血現(xiàn)象。陽性結(jié)果為菌落周圍呈半透明環(huán)的溶血。,第六節(jié)、蠟樣芽胞桿菌,（一）

14、生物學(xué)特性 1、形態(tài)與染色 革蘭氏陽性大桿菌，寬度在1 m或1 m以上，芽孢呈卵圓形，不突出菌體，多位于菌體中央或稍偏于一端。,需氧，最適生長溫度3032。 在肉湯中混濁生長，有菌膜或壁環(huán)，振搖易乳化。 在普通瓊脂平板上，菌落灰白色，不透明，邊緣不整齊，表面粗糙，呈毛玻璃狀或白蠟狀。 在血平板上，菌落呈淺灰色，不透明，似白色毛玻璃狀，有溶血環(huán)。 在甘露醇卵黃多粘菌素平板上，菌落呈粉紅色，具有白色混濁環(huán)（不發(fā)酵甘露醇、產(chǎn)生卵磷脂酶）,2、培養(yǎng)特性,能分解葡萄糖，麥芽糖，蔗糖，水楊苷，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。 不分解乳糖，甘露醇，阿拉伯糖，山梨醇，木糖 H2S（-），尿素酶試驗(yàn)（-）卵磷脂酶（+）， V-P試

15、驗(yàn)（+），液化明膠。,3、生化反應(yīng),食品蠟樣芽胞桿菌數(shù)量106/g（mL）時?？蓪?dǎo)致食物中毒，導(dǎo)致中毒的主要原因是其產(chǎn)生的腸毒素 。 腸毒素類型： 耐熱性腸毒素：10030min不能被破壞，常在米飯中形成。 不耐熱腸毒素：能在各種食物中形成。 臨床癥狀：食物中毒，分為嘔吐型和腹瀉型兩類。,二、致病性,三、檢驗(yàn)方法,1、檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)； GB 4789.142003 2、培養(yǎng)基和試劑 培養(yǎng)基: 肉浸液肉湯培養(yǎng)基 酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基 動力-硝酸鹽培養(yǎng)基 緩沖葡萄糖蛋白胨水 血瓊脂培養(yǎng)基 木糖-明膠培養(yǎng)基 甘露醇卵黃多粘菌素(MYP)瓊脂培養(yǎng)基、 試劑：0.5%堿性復(fù)紅染色液、革蘭氏染色液、3%過氧化氫溶液

16、、甲萘胺-乙酸溶液、對氨基苯磺酸-乙酸溶液。,3、檢驗(yàn)程序,361 12 h 20 h,37，18 h 24 h,361 12 h 20 h,檢 樣 25 g（mL）加225 mL生理鹽水,菌數(shù)計(jì)算,做成10-110-5的稀釋液,選擇性培養(yǎng)基 （分離培養(yǎng)） MYP,營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,生長及菌落觀察,染色鏡檢,生化試驗(yàn),菌株保存,報 告,選擇性培養(yǎng)基 （菌數(shù)測定） MYP,包括四個步驟： 菌數(shù)測定:涂布甘露醇卵黃多粘菌素（MYP） 平板計(jì)數(shù)。 分離培養(yǎng):從MYP上 挑可疑菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。 證實(shí)實(shí)驗(yàn):包括形態(tài)觀察、培養(yǎng)特性、生化性狀和生化分型試驗(yàn)。 與類似菌的鑒別：主要是與蘇云金芽孢桿菌的鑒別。 結(jié)

17、果報告：報告每g（mL）檢樣中所含的蠟樣芽孢桿菌數(shù)。,將樣品稀釋液0.1 mL涂布于甘露醇卵黃多粘菌素（MYP）瓊脂平板上培養(yǎng)后，選取適當(dāng)菌落數(shù)的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)后，從中挑取5個典型菌落做證實(shí)試驗(yàn)。根據(jù)證實(shí)的蠟樣芽孢桿菌的菌落數(shù)計(jì)算出該平板上的菌落數(shù)。 蠟樣芽孢桿菌數(shù)=可疑菌落數(shù)證實(shí)為陽性菌落數(shù)的比例稀釋倍數(shù)10,菌數(shù)測定：,MYP培養(yǎng)基中含有卵黃、甘露醇、多粘菌素和pH指示劑酚紅等。多粘菌素可抑制雜菌的生長。 蠟樣芽孢桿菌不發(fā)酵甘露醇，菌落為粉紅色（否則為黃色）。 該菌產(chǎn)生卵磷脂酶，由于脂肪和卵磷脂被分解，在菌落周圍產(chǎn)生粉紅色的暈。,分離培養(yǎng)和證實(shí)試驗(yàn):,分離培養(yǎng)：從MYP平板上挑可疑菌落

18、到營養(yǎng)瓊脂上進(jìn)行純培養(yǎng)。 證實(shí)試驗(yàn)： （1）形態(tài)觀察 （2）培養(yǎng)特性（3）生化性狀及生化分型 生化性狀 本菌有動力；能產(chǎn)生卵磷脂酶和酪蛋白酶；過氧化氫酶試驗(yàn)陽性；溶血；不發(fā)酵甘露醇和木糖；常能液化明膠和使硝酸鹽還原；在厭氧條件下能發(fā)酵葡萄糖。生化分型 根據(jù)蠟樣芽孢桿菌對檸檬酸鹽利用、硝酸鹽還原、淀粉水解、V-P反應(yīng)、明膠液化性狀的試驗(yàn)，分成不同的型別。,表1 蠟樣芽孢桿菌生化分型,表2 蠟樣芽孢桿菌與其他類似菌的鑒別,與類似菌鑒別：,鑒別： 蠟樣芽孢桿菌在形態(tài)以及生化性狀上與蘇云金芽孢桿菌極為相似 ，要進(jìn)行鑒別。主要是通過觀察伴孢晶體來判斷，蘇云金芽孢桿菌有伴孢晶體，蠟樣芽孢桿菌無。,蘇云金芽孢桿菌及其伴孢晶體,蠟樣芽孢桿菌,第七節(jié)、其它致病菌的檢驗(yàn),一、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn) GB 4789.30-2010 食品