生物化學(xué)核酸概要

1、第 二 章核酸的結(jié)構(gòu)和功能,Structure and Function of Nucleic Acid,第一節(jié) 核酸的概念和重要性,核 酸(nucleic acid),是以核苷酸為基本組成單位的生物大分子，攜帶和傳遞遺傳信息。是生命最基本的物質(zhì)之一。,核酸的發(fā)現(xiàn)和研究工作進(jìn)展,1868年 Fridrich Miescher從膿細(xì)胞中提取“核素” 1944年 Avery等人證實(shí)DNA是遺傳物質(zhì) 1953年 Watson和Crick發(fā)現(xiàn)DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu) 1968年 Nirenberg發(fā)現(xiàn)遺傳密碼 1975年 Temin和Baltimore發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶 1981年 Gilbert和Sanger建

2、立DNA 測序方法 1985年 Mullis發(fā)明PCR 技術(shù) 1990年 美國啟動(dòng)人類基因組計(jì)劃(HGP) 1994年 中國人類基因組計(jì)劃啟動(dòng) 2001年 美、英等國完成人類基因組計(jì)劃基本框架,第二節(jié)核酸的類別、分布和組成,一、核酸的分類及分布,90%以上分布于細(xì)胞核，其余分布于線粒體、葉綠體、質(zhì)粒等。,分布于胞核、胞液。,(deoxyribonucleic acid, DNA),(ribonucleic acid, RNA),脫氧核糖核酸,核糖核酸,攜帶遺傳信息，決定細(xì)胞和個(gè)體的基因型(genotype)。,參與細(xì)胞內(nèi)DNA遺傳信息的表達(dá)。某些病毒RNA也可作為遺傳信息的載體。 主要包括mR

3、NA、rRNA、tRNA,二、核酸的化學(xué)組成,1. 元素組成 C、H、O、N、P（910%）,2. 基本構(gòu)成單位核苷酸, 堿基(base)：嘌呤堿，嘧啶堿, 戊糖(ribose)：核糖，脫氧核糖, 磷酸(phosphate),核苷酸由堿基、戊糖和磷酸三部分組成,嘌呤(purine),腺嘌呤(adenine, A),鳥嘌呤(guanine, G),（1）堿 基,嘧啶(pyrimidine),胞嘧啶(cytosine, C),尿嘧啶(uracil, U),胸腺嘧啶(thymine, T),N,N二甲基鳥嘌呤,N6-異戊烯腺嘌呤,雙氫尿嘧啶,4-巰尿嘧啶,稀有堿基,（2）戊 糖,第三節(jié)核苷與核苷酸,

4、核苷：AR, GR, UR, CR 脫氧核苷：dAR, dGR, dTR, dCR,一、核苷的結(jié)構(gòu),1. 核苷(ribonucleoside)的形成,堿基和核糖（脫氧核糖）通過糖苷鍵連接形成核苷（脫氧核苷）。,核苷：戊糖與含氮堿基脫水縮合而生成,假尿嘧啶（）核苷的糖苷鍵不是C-N鍵，而是C-C鍵,2、修飾核苷,核苷酸： AMP, GMP, UMP, CMP 脫氧核苷酸： dAMP, dGMP, dTMP, dCMP,二、 核苷酸(ribonucleotide)的結(jié)構(gòu)與命名,核苷（脫氧核苷）和磷酸以磷酸酯鍵連接形成核苷酸（脫氧核苷酸）。,1、核苷酸的結(jié)構(gòu)與命名,2、體內(nèi)重要的游離核苷酸及其衍生物

5、,含核苷酸的生物活性物質(zhì)： NAD+、NADP+、CoA-SH、FAD 等都含有 AMP,多磷酸核苷酸：NMP，NDP，NTP,環(huán)化核苷酸: cAMP，cGMP,AMP,ADP,ATP,cAMP,幾種稀有核苷酸,第四節(jié)DNA的結(jié)構(gòu),1、核苷酸的連接,核苷酸之間以3,5-磷酸二酯鍵連接形成多核苷酸鏈，即核酸。,C,G,A,一、DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu),定義: DNA中脫氧核苷酸的排列順序。 由于脫氧核苷酸間的差異主要是堿基不同，所以也稱為堿基序列。,書寫方法,5 pApCpTpGpCpT-OH 3,5 A C T G C T 3,核酸具有方向性，一端稱為5-端，另一端稱為3-端,二、 DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)雙

6、螺旋結(jié)構(gòu),（一）DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)提出的依據(jù),（二） DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn) （Watson, Crick, 1953）,DNA分子由兩條反向平行的多聚脫氧核苷酸鏈沿一個(gè)假設(shè)的中心軸相互盤繞，兩條鏈均為右手螺旋。 磷酸和脫氧核糖單位作為不變的骨架位于外側(cè)，作為可變成分的堿基位于內(nèi)側(cè)，鏈間堿基按AT，GC配對形成氫鍵。,堿基對平面與螺旋軸幾乎垂直，相鄰堿基平面垂直距離0.34nm，DNA雙鏈所形成的螺旋直徑2nm，螺旋結(jié)構(gòu)每隔10個(gè)堿基對重復(fù)一次，螺距為3.4nm。DNA雙螺旋分子表面形成“大溝”與“小溝”。,3.4nm,堿基堆積力維持螺旋縱向穩(wěn)定，氫鍵維持雙鏈橫向穩(wěn)定。,（三）DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)

7、的種類,三、DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu),（一）DNA的超螺旋結(jié)構(gòu),超螺旋結(jié)構(gòu)： DNA雙螺旋鏈再盤繞即形成超螺旋結(jié)構(gòu)。,正超螺旋(positive supercoil) 盤繞方向與DNA雙螺旋方同相同,負(fù)超螺旋(negative supercoil) 盤繞方向與DNA雙螺旋方向相反,意 義 DNA超螺旋結(jié)構(gòu)整體或局部的拓?fù)鋵W(xué)變化及其調(diào)控對于DNA復(fù)制和RNA轉(zhuǎn)錄過程具有關(guān)鍵作用。,（二）原核生物DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu),（三）DNA在真核生物細(xì)胞核內(nèi)的組裝,真核生物染色體由DNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成，其基本單位是核小體(nucleosome)。,核小體的組成 DNA：約200bp 組蛋白：H1 H2A，H2B H3 H

8、4,真核生物中的核小體結(jié)構(gòu)：,DNA 雙螺旋形成超螺旋結(jié)構(gòu)，再與核內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合，形成核小體的結(jié)構(gòu) DNA 纏繞八聚體 1.75圈，然后與H1連接，形成串珠狀結(jié)構(gòu),真核生物染色體DNA組裝不同層次的結(jié)構(gòu),DNA （2nm）,核小體鏈（ 11nm，每個(gè)核小體200bp）,纖絲（ 30nm，每圈6個(gè)核小體）,突環(huán)（ 150nm，每個(gè)突環(huán)大約75000bp）,玫瑰花結(jié)（ 300nm ，6個(gè)突環(huán)）,螺旋圈（ 700nm，每圈30個(gè)玫瑰花）,染色體（ 1400nm， 每個(gè)染色體含10個(gè)玫瑰花200bp）,意義：有規(guī)律壓縮體積，減少占用的空間,四、DNA的功能,DNA的基本功能是以基因的形式荷載遺傳信息，

9、并作為基因復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的模板。它是生命遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是個(gè)體生命活動(dòng)的信息基礎(chǔ)。,基因從結(jié)構(gòu)上定義，是指DNA分子中的特定區(qū)段，其中的核苷酸排列順序決定了基因的功能。,基因（gene）: DNA分子中具有特定生物學(xué)功能的片段。 基因組（genome）：一個(gè)生物體的全部DNA序列總稱。 基因組的大小與生物的復(fù)雜性有關(guān)，如病毒SV40的基因組大小為5.1103bp，大腸桿菌為5.7106bp，人為3109bp。,第五節(jié) RNA的結(jié)構(gòu)與功能,Structure and Function of RNA,RNA通常以單鏈形式存在，但也可形成局部的雙螺旋結(jié)構(gòu)。 RNA分子的種類較多，分子大小變化較大，功能

10、多樣化。,一、RNA的一級(jí)結(jié)構(gòu),1、定義 RNA中核苷酸的排列順序。 DNA與RNA一級(jí)結(jié)構(gòu)上的不同點(diǎn)？,RNA與DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的差異 DNA RNA 戊糖 脫氧核糖 核糖 堿基 AGCT AGCU 不含稀有堿基 含稀有堿基,2、RNA的種類、分布、功能,二、信使RNA(messenger RNA),5-帽子結(jié)構(gòu) 編碼序列 3-多聚A結(jié)構(gòu),1、真核細(xì)胞mRNA結(jié)構(gòu)特點(diǎn),1.大多數(shù)真核mRNA的5末端均在轉(zhuǎn)錄后加上一個(gè)7-甲基鳥苷，同時(shí)第一個(gè)核苷酸的C2也是甲基化，形成帽子結(jié)構(gòu)：m7GpppN-。,2.大多數(shù)真核mRNA的3末端有一個(gè)多聚腺苷酸(polyA)結(jié)構(gòu)，稱為多聚A尾。,帽子結(jié)構(gòu),5,5

11、,mRNA核內(nèi)向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位 mRNA的穩(wěn)定性維系 翻譯起始的調(diào)控,帽子結(jié)構(gòu)和多聚A尾的功能,編碼區(qū)：mRNA分子中每三個(gè)相鄰的核苷酸組成一組，在蛋白質(zhì)翻譯合成時(shí)代表一個(gè)特定的氨基酸，這種核苷酸三聯(lián)體稱為遺傳密碼（coden） 功能:為蛋白質(zhì)的合成提供模板,2、原核細(xì)胞mRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),* mRNA的功能:為蛋白質(zhì)的合成提供模板 把DNA所攜帶的遺傳信息，按堿基互補(bǔ)配對原則，抄錄并傳送至核糖體，用以決定其合成蛋白質(zhì)的氨基酸排列順序。,1、tRNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn) tRNA是分子最小(7090個(gè)核苷酸） 含 10-20% 稀有堿基，如 DHU、等 3末端為 CCA-OH(氨基酸臂） 5末端大多數(shù)為

12、G 具有 TC,三、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(transfer RNA),2、tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu) 三葉草形 氨基酸臂 DHU環(huán) 反密碼環(huán) 額外環(huán) TC環(huán),氨基酸臂,額外環(huán),3OH 端可以結(jié)合氨基酸 反密碼環(huán)可以與mRNA上的密碼子配對，將合適的氨基酸攜帶到合適的位置,tRNA的功能：作為各種氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)載體在蛋白質(zhì)合成中轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸原料,tRNATyr: 可以和Tyr結(jié)合的tRNA Tyr-tRNATyr : 結(jié)合了Tyr的tRNA,命名原則：,3、tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu) 倒L形,* tRNA的功能 活化、搬運(yùn)氨基酸到核糖體，參與蛋白質(zhì)的翻譯。,四、核蛋白體RNA(ribosomal RNA),* rRNA的功能

13、 參與組成核蛋白體，作為蛋白質(zhì)生物合成的場所。,rRNA是細(xì)胞中含量最多的RNA，占總量的80%。,5sRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu),* rRNA的種類（根據(jù)沉降系數(shù)）,真核生物 5S rRNA 28S rRNA 5.8S rRNA 18S rRNA,原核生物 5S rRNA 23S rRNA 16S rRNA,核蛋白體的組成,五 、其他小分子RNA及RNA組學(xué),除了上述三種RNA外，細(xì)胞的不同部位存在的許多其他種類的小分子RNA，統(tǒng)稱為非mRNA小RNA(small non-messenger RNAs, snmRNAs),snmRNAs,snmRNAs的種類 核內(nèi)小RNA 核仁小RNA 胞質(zhì)小RNA

14、催化性小RNA 小片段干涉 RNA,snmRNAs的功能 參與hnRNA和rRNA的加工和轉(zhuǎn)運(yùn)。,RNA組學(xué)研究細(xì)胞中snmRNAs的種類、結(jié)構(gòu)和功能。同一生物體內(nèi)不同種類的細(xì)胞、同一細(xì)胞在不同時(shí)間、不同狀態(tài)下snmRNAs的表達(dá)具有時(shí)間和空間特異性。,RNA組學(xué),核 酸 的 理 化 性 質(zhì) The Physical and Chemical Characters of Nucleic Acid,第 六 節(jié),一、核酸的一般理化性質(zhì) 核酸具有兩性解離性質(zhì)； DNA分子粘度大；RNA 分子粘度小,二、紫外吸收,核酸分子中所含的嘌呤和嘧啶分子中都有共軛雙鍵，使核酸分子在紫外光260nm波長處有最大吸

15、收峰?？捎糜诤怂岬亩ㄐ院投繙y定。,1.判斷核酸樣品的純度 DNA純品: OD260/OD280 = 1.8 RNA純品: OD260/OD280 = 2.0 2.DNA或RNA的定量 OD260=1.0相當(dāng)于 50g/ml雙鏈DNA 40g/ml單鏈DNA（或RNA） 20g/ml寡核苷酸,OD260的應(yīng)用,三、DNA的變性(denaturation),定義：在物理、化學(xué)因素影響下，DNA堿基對間的氫鍵斷裂，雙螺旋解開變成無規(guī)則線型單鏈，變性并不涉及共價(jià)鍵的斷裂。,方法：過量酸，堿，加熱，變性試劑如尿素、 酰胺以及某些有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮等。,變性后其它理化性質(zhì)變化：,增色效應(yīng) 粘度下降 比

16、旋度下降浮力密度升高 酸堿滴定曲線改變生物活性喪失,DNA變性的本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂,例：變性引起紫外吸收值的改變,DNA的紫外吸收光譜,增色效應(yīng)：DNA變性時(shí)其溶液OD260增高的現(xiàn)象。,熱變性,解鏈曲線：如果在連續(xù)加熱DNA的過程中以溫度對A260（absorbance,A,A260代表溶液在260nm處的吸光率）值作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。,Tm：變性是在一個(gè)相當(dāng)窄的溫度范圍內(nèi)完成，在這一范圍內(nèi)，紫外光吸收值達(dá)到最大值的50%時(shí)的溫度稱為DNA的解鏈溫度，又稱熔解溫度(melting temperature, Tm)。,Tm主要與下列因素相關(guān),DNA的均一性 溶液的離子強(qiáng)度 G-C

17、的含量,Tm的高低與DNA分子中G+C的含量有關(guān), G+C的含量越高，則Tm越高。,四、DNA的復(fù)性,DNA復(fù)性(renaturation)的定義 在適當(dāng)條件下，變性DNA的兩條互補(bǔ)鏈可恢復(fù)天然的雙螺旋構(gòu)象，這一現(xiàn)象稱為復(fù)性。,減色效應(yīng) DNA復(fù)性時(shí)，其溶液OD260降低。,熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，這一過程稱為退火(annealing) 。,兩條來源不同的單鏈核酸（DNA或RNA），只要它們有大致相同的互補(bǔ)堿基順序，在適宜的條件（溫度及離子強(qiáng)度）下，經(jīng)退火處理即可復(fù)性，形成新的雜種雙螺旋，這一現(xiàn)象稱為核酸的分子雜交。,五、分子雜交與探針技術(shù),核酸雜交可以是DNA-DNA，也可以是D

18、NA-RNA雜交。不同來源的，具有大致相同互補(bǔ)堿基順序的核酸片段稱為同源順序。,探針技術(shù),利用核酸的分子雜交，可以確定或?qū)ふ也煌锓N中具有同源順序的DNA或RNA片段。,在核酸雜交分析過程中，常將已知順序的核酸片段用放射性同位素或生物素進(jìn)行標(biāo)記。這種帶有一定標(biāo)記的已知順序的核酸片段稱為探針。,核酸分子雜交的應(yīng)用 研究DNA分子中某一種基因的位置 定兩種核酸分子間的序列相似性 檢測某些專一序列在待檢樣品中存在與否 是基因芯片技術(shù)的基礎(chǔ),Southern印跡法,DNA分子,限制片段,限制性酶切割,瓊脂糖電泳,轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,與放射性標(biāo)記DNA探針雜交,放射自顯影,帶有DNA片段的凝膠,凝膠,濾膜,用緩沖液轉(zhuǎn)移DNA,吸附有DNA片段的膜,酶法序列分析的原理,酶反應(yīng),電泳方向,dATPdCTPdGTPdTTP,+ddATP,dATPdCTPdGTPdTTP,+ddTTP,dATPdCTPdGTPdTTP,+ddGTP,dATPdCTPdGTPdTTP,+ddCTP,A C G T,第七