細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法

1、細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法,細(xì)胞培養(yǎng)的污染和檢測,細(xì)胞培養(yǎng)中常用的染色方法,培養(yǎng)細(xì)胞的觀察,A,C,B,目錄,培養(yǎng)細(xì)胞的觀察,無論是研究體外細(xì)胞的增殖生長狀態(tài)還是生物學(xué)性狀，都需要對其進(jìn)行觀察和檢測，其內(nèi)容涉及形態(tài)生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、生理生化、分子生物學(xué)等多學(xué)科的技術(shù)手段。這里主要介紹觀察檢測體外培養(yǎng)物最常用的技術(shù)方法。,相差顯微鏡,相差顯微鏡是荷蘭科學(xué)家Zernike于1935年發(fā)明的，用于觀察未染色標(biāo)本的顯微鏡?；罴?xì)胞和未染色的生物標(biāo)本，因細(xì)胞各部細(xì)微結(jié)構(gòu)的折射率和厚度的不同，光波通過時(shí)，波長和振幅并不發(fā)生變化，僅相位發(fā)生變化（x相位差），這種相位差人眼無法觀察。而相差顯微鏡通過改變這種相

2、位差，并利用光的衍射和干涉現(xiàn)象，把相差變?yōu)檎穹顏碛^察活細(xì)胞和未染色的標(biāo)本。相差顯微鏡和普通顯微鏡的區(qū)別是：用環(huán)狀光闌代替可變光闌， 用帶相板的物鏡代替普通物鏡，并帶有一個(gè)合軸用的望遠(yuǎn)鏡。,一、相差顯微鏡觀察：能增強(qiáng)結(jié)構(gòu)之間的反差,1、主要裝置 （1）環(huán)裝光柵 不同倍數(shù)的相差物鏡要用相應(yīng)的環(huán)狀光闌 （2）相板 相差板上上裝有吸收膜及推遲相位的相位膜 （3）中心望遠(yuǎn)鏡 輔助望遠(yuǎn)鏡,培養(yǎng)細(xì)胞的觀察,培養(yǎng)細(xì)胞的觀察,2、觀察活細(xì)胞的方法 將相差裝置與倒置光裝置結(jié)合起來而制造的倒置相差顯微鏡廣泛用于觀察生長在瓶皿底面的細(xì)胞。,培養(yǎng)細(xì)胞的觀察,3、相差物鏡的選擇與使用 正（暗,即標(biāo)本比周圍環(huán)境暗）反差適

3、用于物體細(xì)微結(jié)構(gòu)和形態(tài)、計(jì)數(shù)、運(yùn)動的觀察。PL（低亮，視場平坦型物鏡）相差物鏡常用于折射率比較弱的物體，PLL（低低亮，長工作距離平場物鏡）則適用于折射強(qiáng)的物體。 負(fù)（明，即標(biāo)本比周圍環(huán)境亮）反差適用于物體形態(tài)、計(jì)數(shù)和物體運(yùn)動的觀察，物體折射率比較弱是采用NM（中負(fù)）相差物鏡，折射率比較強(qiáng)時(shí)采用NH（高負(fù)）相差物鏡。,培養(yǎng)細(xì)胞的觀察,4、相差顯微鏡使用注意事項(xiàng) 1）當(dāng)換不同倍率的物鏡時(shí)，要選用一致的相板和相環(huán)，并重新調(diào)中，否則成像效果不佳； 2）載物片或培養(yǎng)瓶的表面要平整、均勻、干凈，標(biāo)本不能太厚，以免影響觀測效果； 3）標(biāo)本要在有水的環(huán)境中（如培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)液、水封片等）成像效果才明顯；4）光

4、路最好加單色（如黃綠色）濾光片以提高相差顯微鏡的分辨率。,培養(yǎng)細(xì)胞的觀察,二、細(xì)胞計(jì)數(shù)法 1、細(xì)胞計(jì)數(shù)法是利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù) 目，以測定細(xì)胞增殖和調(diào)整細(xì)胞濃度的一種方法。 2、細(xì)胞生長曲線是觀察細(xì)胞在一代生存期內(nèi)的增生過程的重要指標(biāo)。只有具備自身穩(wěn)定生長特性的細(xì)胞才適合在觀察細(xì)胞生長變化的實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用。,培養(yǎng)細(xì)胞的觀察,3、細(xì)胞分裂指數(shù)是指分裂期細(xì)胞在全部細(xì)胞中所占的百分率，用以表示細(xì)胞的增殖旺盛程度。一般取1000個(gè)細(xì)胞中的細(xì)胞分裂相數(shù)。 4、細(xì)胞貼壁率又稱接種存活率，用于觀察貼壁附著生長細(xì)胞，主要反映細(xì)胞的生存能力（只有活細(xì)胞才貼壁）和部分底物材料的生物相容性。,培養(yǎng)細(xì)胞

5、的觀察,5、細(xì)胞周期 這里的細(xì)胞周期僅指一個(gè)細(xì)胞的分裂生長周期 時(shí)間，而不是指細(xì)胞群體倍增時(shí)間?？衫门囵B(yǎng)細(xì) 胞來研究細(xì)胞動力學(xué)、DNA合成代謝和有絲分裂。 細(xì)胞周期的時(shí)間測定有兩種方法。 （1）同位素標(biāo)記測定法 （2）流式細(xì)胞儀測定法 6、MTT(二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽）比色法測定 細(xì)胞活力。,細(xì)胞培養(yǎng)中常用的染色方法-活體染色,一、活體染色 體外活體染色就是在體外條件下用某種活體染料對活的組織或細(xì)胞進(jìn)行染色，而不影響活細(xì)胞的生命活動的一種方法。 1、活體染料的類別 可分為堿性和酸性活體染料兩大類。 堿性：噻嗪類（次甲基藍(lán)、甲苯膠藍(lán)），亞噴類（亮焦 油藍(lán)、亮焦油紫），吖嗪類（中性紅、詹納斯

6、綠），三酚苯甲烷類（甲基紫、維克多利亞藍(lán)）。 酸性：臺盼藍(lán)、剛果紅、吡咯藍(lán)。 體外活體染色一般用堿性活體染料，酸性活體染料只用于體內(nèi)活體染色。,細(xì)胞培養(yǎng)中常用的染色方法-活體染色,2、活體染色方法 （1）臺盼藍(lán)染色 1）用Hanks液（最常用的無機(jī)鹽溶液和平衡鹽溶液，主要用于洗滌細(xì)胞和組織的，也是合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)液。如果含有鈣鎂離子的話，當(dāng)用消化液消化細(xì)胞時(shí)，鈣鎂離子會破壞消化液的活力。）配制0.1%臺盼藍(lán)溶液； 2）用0.5%的胰蛋白酶：0.2%EDTA=1:1混合液消化培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞； 3）加入適量Hanks液制成細(xì)胞懸液； 4）每毫升細(xì)胞懸液加入10l0.1%臺盼藍(lán)溶液，混勻； 5）用毛

7、細(xì)吸管吸少許混合液置細(xì)胞計(jì)數(shù)板，并在顯微鏡下計(jì)數(shù)； 6）計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞中的活細(xì)胞（折光性強(qiáng)且不著色）和死細(xì)胞（染上藍(lán)色）數(shù)目。,細(xì)胞培養(yǎng)中常用的染色方法-活體染色,細(xì)胞培養(yǎng)中常用的染色方法-活體染色,（2）吖啶橙熒光染色法 吖啶橙用于直接染色觀察活細(xì)胞或固定染色觀察細(xì)胞。與DNA結(jié)合呈亮綠色，與RNA結(jié)合呈橘紅色至火紅色。,細(xì)胞培養(yǎng)中常用的染色方法-活體染色,吖啶橙/溴化乙錠雙熒光染色,細(xì)胞培養(yǎng)中常用的染色方法-染料排除檢測法,二、染料排除檢測法 由于死細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，某些染料可大量進(jìn)入?yún)s不被排出，因而細(xì)胞顯示一定顏色。而活細(xì)胞由于能排出進(jìn)入細(xì)胞的染料，故不易著色。 1、臺盼藍(lán)

8、排除檢測法,細(xì)胞培養(yǎng)中常用的染色方法-染料排除檢測法,2、溴化乙錠和碘化丙錠排除檢測法 EB和PI均為熒光染料，可與DNA特異性結(jié)合。,細(xì)胞培養(yǎng)的污染與檢測,在細(xì)胞培養(yǎng)中，凡是與培養(yǎng)無關(guān)的雜質(zhì)的混入培養(yǎng)系統(tǒng)稱為污染。對于組織細(xì)胞培養(yǎng)工作來說，污染是時(shí)常存在的，因此要努力避免污染的發(fā)生。污染一般包括微生物、化學(xué)物、細(xì)胞等，其中微生物污染較多。以下著重介紹微生物的污染、預(yù)防與檢測。,細(xì)胞培養(yǎng)的污染與檢測-污染途徑,一、污染途徑 1、空氣 空氣是微生物及粉塵顆粒傳播的最主要途徑。 2、器材 各種培養(yǎng)皿及器械消毒不徹底和洗刷不干凈導(dǎo)致污染。 3、操作 無菌操作觀念不強(qiáng)、實(shí)驗(yàn)操作馬虎、動作不準(zhǔn)確、使用污

9、染的器具或密封不嚴(yán)等，都可能造成污染。同時(shí)培養(yǎng)兩種以上細(xì)胞，操作不規(guī)范，交叉使用吸管或者營養(yǎng)液瓶等會導(dǎo)致細(xì)胞交叉感染。,細(xì)胞培養(yǎng)的污染與檢測-污染途徑,4、血清 有的市售血清制備水平低、檢測不嚴(yán)，常被支原體和病毒污染。 5、組織樣本 初代組織常有污染，有的在手術(shù)中污染，有的本身可能是被污染的組織（如已發(fā)生潰爛的腫瘤組織）。手術(shù)用碘酒消毒后，擦拭不凈從而出現(xiàn)碘污染。,細(xì)胞培養(yǎng)的污染與檢測,二、污染對培養(yǎng)細(xì)胞的影響與檢測 體外培養(yǎng)的細(xì)胞自身沒有抵抗污染的能力，而且培養(yǎng)基中加入抗生素的抗污染能力也很有限，因而培養(yǎng)細(xì)胞一旦發(fā)生污染多數(shù)將無法挽回。一般在細(xì)胞受到有害污染的早期或污染較輕時(shí)，如果能及時(shí)處理

10、并去除污染物，部分細(xì)胞有可能恢復(fù)，所以對培養(yǎng)細(xì)胞的污染與檢測極其重要。,細(xì)胞培養(yǎng)的污染與檢測,1、細(xì)菌污染及檢測 細(xì)菌是一種原核生物，其大小以微米計(jì)。常見的污 染菌有革蘭式陰性菌（其中白色葡萄菌等比較常見）和 E.coli、假單胞菌等。細(xì)菌污染初期不易判斷。有懷疑時(shí) 可取細(xì)胞懸液離心沉淀后加入無抗生素的培養(yǎng)液中培養(yǎng) 觀察24h，看是否為陽性（受到污染）結(jié)果。 多數(shù)情況下受到細(xì)菌污染后培養(yǎng)液短期內(nèi)顏色變黃，產(chǎn)大 量酸性物質(zhì)，出現(xiàn)明顯渾濁。還可用倒置顯微鏡觀察，現(xiàn)象明 顯。 青霉素、鏈霉素預(yù)防細(xì)菌污染有效。,細(xì)胞培養(yǎng)的污染與檢測,2、真菌的污染與檢測 在微生物污染中，以真菌的污染最多，常見的有煙

11、曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌。 真菌污染后易發(fā)現(xiàn)，大多呈白色或淺黃色小點(diǎn)漂浮 于培養(yǎng)液表面，肉眼可見，還可用倒置顯微鏡觀察散在 生長在培養(yǎng)液中的真菌。 瓶外的污染物要及時(shí)用酒精棉球擦洗干凈，以防其 通過瓶口傳入瓶內(nèi)。 抗真菌劑對預(yù)防和排除真菌污染有效。,細(xì)胞培養(yǎng)的污染與檢測,3、支原體污染與檢測 支原體是一種介于細(xì)菌和病毒之間、能獨(dú)立生活的最小微生物，最小的直徑0.2微米，約有1%可通過濾菌器，無細(xì)胞壁，形態(tài)呈多形性，可為圓形、絲狀或梨形。 目前常用檢測方法有相差顯微鏡檢測法、DNA熒光處理法、電鏡檢測法、低張?zhí)幚淼匾录t染色觀察、免疫學(xué)法、 -胸腺嘧啶滲入、支原體培養(yǎng)法及PC

12、R法等。,細(xì)胞培養(yǎng)的污染與檢測,4、病毒的污染與檢測 病毒是一種能通過細(xì)菌濾器，大小以納米計(jì)，不能 單獨(dú)利用外界營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行自體繁殖的微生物。病毒進(jìn) 入細(xì)胞后會進(jìn)行裝配形成新的病毒，或?qū)⑦z傳物質(zhì)整合 到宿主DNA上，從而影響到細(xì)胞的生長或干擾實(shí)現(xiàn)結(jié)果 的準(zhǔn)確性。對病毒進(jìn)行檢測主要有細(xì)胞直接觀察法、動 物接種檢查法、電子顯微鏡檢查法、免疫學(xué)及PCR法等。,細(xì)胞培養(yǎng)的污染與檢測,5、細(xì)胞交叉污染檢測 細(xì)胞間交叉污染是由于在培養(yǎng)操作過程中各種細(xì)胞同時(shí)進(jìn) 行培養(yǎng)，而所有器具或液體混雜使用所致。這種污染有的變化 輕微不易察覺，有的可能因污染細(xì)胞具有生長優(yōu)勢而使原培養(yǎng) 細(xì)胞生長受到抑制，最終死亡。常用觀察

13、細(xì)胞形態(tài)、檢查細(xì)胞 的標(biāo)記物等方法檢查交叉污染的細(xì)胞。 為有效防止交叉污染，應(yīng)該做到： 1）器具嚴(yán)格區(qū)分，做好標(biāo)記； 2）換液或傳代操作時(shí)，注射器和滴管不要觸及培養(yǎng)液瓶瓶口。 3）從別處轉(zhuǎn)來的細(xì)胞或自己建立的細(xì)胞系都要早期留有充足的凍存儲備。,細(xì)胞培養(yǎng)的污染與檢測-污染的預(yù)防,三、污染的預(yù)防 1、培養(yǎng)操作前的準(zhǔn)備 1）定期清洗或更換超凈工作臺的空氣濾網(wǎng)，定期檢查超凈工作臺的空氣凈化標(biāo)準(zhǔn)； 2）檢查培養(yǎng)皿是否有消毒標(biāo)志； 3）檢查新配置的培養(yǎng)液，取樣檢菌一周后確認(rèn)無菌方可使用； 4）操作前提前30min啟動超凈工作臺及其紫外消毒燈； 5）操作者應(yīng)清洗雙手，如有呼吸道感染應(yīng)戴口罩。,細(xì)胞培養(yǎng)的污染

14、與檢測-污染的預(yù)防,2、培養(yǎng)操作時(shí)注意事項(xiàng) 1）工作臺上的所有培養(yǎng)瓶瓶口不能與工作臺上的風(fēng)向相逆，不能用手碰器皿無菌部分； 2）在安裝吸管帽、開啟或封閉瓶口時(shí)要經(jīng)火焰灼燒，并在火焰附近進(jìn)行； 3）吸取培養(yǎng)液、細(xì)胞懸液時(shí)，應(yīng)專管專用； 4）使用培養(yǎng)液前不宜過早開瓶，開瓶后培養(yǎng)液保持斜立，培養(yǎng)的細(xì)胞在處理之前勿過早的暴露于空氣中； 5）操作時(shí)不要交談咳嗽以防止唾沫和呼出的氣流所造成的污染； 6）操作完后應(yīng)整理好工作臺面，用消毒劑抹拭工作面，關(guān)閉超凈工作臺。,細(xì)胞培養(yǎng)的污染與檢測-污染的預(yù)防,3、其他注意事項(xiàng) 1）及早凍存有價(jià)值的培養(yǎng)物，重要細(xì)胞系（株）的傳代工 作應(yīng)由兩人獨(dú)立完成； 2）購入未滅活

15、血清應(yīng)于56水浴滅活30min，以使血清中 的補(bǔ)體和支原體滅活； 3）避免誘導(dǎo)抗藥細(xì)菌，應(yīng)定期更換培養(yǎng)系統(tǒng)中的抗生素， 或盡可能不用抗生素； 4）對新引進(jìn)的細(xì)胞株應(yīng)加強(qiáng)觀察，防止外來污染源； 5)定期用消毒劑清潔二氧化碳培養(yǎng)箱。,細(xì)胞培養(yǎng)的污染與檢測-污染排除,四、污染排除 培養(yǎng)細(xì)胞的污染一旦確定，多數(shù)將無法救治。如果污染的細(xì)胞不具備重要價(jià)值則盡快棄之，防止造成更大的污染，只有那些必須保留的貴重細(xì)胞和單抗細(xì)胞等，才有必要進(jìn)行污染排除。防止關(guān)鍵在于嚴(yán)格無菌操作。,細(xì)胞培養(yǎng)的污染與檢測-污染排除,1、抗生素的應(yīng)用 平時(shí)抗生素主要用來殺滅微生物，而細(xì)胞培養(yǎng)工作采用抗生素多為預(yù)防污染。常用多鐘抗生素聯(lián)

16、合應(yīng)用，用于預(yù)防比污染后使用好。使用多了容易使微生物產(chǎn)生抗藥性，因此盡量少用。但對于一些有價(jià)值的細(xì)胞，仍需用抗生素挽救。部分抗生素參考用量和效果如下表：,細(xì)胞培養(yǎng)的污染與檢測-污染排除,2、加溫處理 根據(jù)支原體對熱耐性差的特點(diǎn)，有人把受污染的細(xì)胞置41中總1510h，最長可達(dá)18h，以殺滅支原體。 41對培養(yǎng)的細(xì)胞本身也有很大影響，所以一般都要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定對培養(yǎng)細(xì)胞的影響降到最小的同時(shí)最大限度的殺傷支原體的處理時(shí)間。,細(xì)胞培養(yǎng)的污染與檢測-污染排除,3、動物體內(nèi)接種除菌法 此方法適用于在連續(xù)傳代培養(yǎng)中的腫瘤細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞中，清除細(xì)菌和支原體污染的方法。 把支原體污染的腫瘤細(xì)胞接種在同種動物皮下或腹腔中，借助其免疫系統(tǒng)消滅支原體，待腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)生長一段時(shí)間后取出細(xì)胞再進(jìn)行培養(yǎng)繁殖。,細(xì)胞培養(yǎng)的污染與檢測-污染排除,4、巨噬細(xì)胞吞噬法 從動物腹腔采取巨噬細(xì)胞，為排除其他細(xì)胞成分，