10第十章 免疫細胞的分離和功能檢測.ppt

1、第十章 免疫細胞的分離和功能檢測,吳正吉 副教授 重慶醫(yī)藥高等?？茖W校醫(yī)學技術(shù)系,目錄,吞噬細胞的分離和收集,返回總目錄,3,免疫細胞的分離及檢測,檢測：各類免疫細胞及其亞群的數(shù)量和功能測定 方法：體外法為主 目的：判斷機體免疫狀態(tài) 意義：探討疾病的發(fā)病機制、發(fā)展、預(yù)后、療效,免疫細胞的分離 是指將各種參與免疫反應(yīng)的 細胞從血液或組織中分離出來,免疫細胞種類,大吞噬細胞:即單核-吞噬細胞系統(tǒng) 小吞噬細胞:即中性粒細胞,第一節(jié) 吞噬細胞的分離和收集,吞噬細胞的種類,特征性標志 CD14 分離技術(shù) Pecoll密度梯度分離法 流式細胞儀分離技術(shù) 免疫磁珠分離法：為目前較常用的方法 黏附法,一、吞噬

2、細胞的分離,（一）單核細胞的分離,免疫磁珠分離法,斑蝥敷貼法分離人巨噬細胞 動物的巨噬細胞直接從腹腔滲出液中獲取,（二）巨噬細胞的分離,聚合物加速沉降法 可從外周血中分離出白細胞,RBC,血漿,(抗凝血),WBC,RBC,Ficoll分離法 可從白細胞中分離出純化的中性粒細胞,（三）中性粒細胞的分離,Ficoll-Hypaque密度梯度離心分離中性粒細胞,吞噬細胞的吞噬活動大體分為趨化、吞噬和胞內(nèi)殺滅作用三個階段，據(jù)此建立相應(yīng)的檢測方法。 （一）中性粒細胞功能檢測技術(shù) （二）巨噬細胞功能檢測技術(shù),二、相關(guān)功能檢測,細胞趨化功能的檢測 吞噬功能的檢測 殺菌功能的檢測,（一）中性粒細胞功能檢測,體

3、內(nèi)試驗法：皮膚窗法 體外試驗法：濾膜滲透法 瓊脂糖平板法,趨化功能檢測檢測細胞運動功能,皮膚窗法 在受檢者前臂屈側(cè)中央3范圍內(nèi)，搔刮皮膚后，用蓋玻片壓緊固定，在第2，5，8，12，24，36小時各取樣一次，染色觀察中性粒細胞聚集開始時間、聚集程度等。健康正常人一般23h后開始聚集，達50100個，6小時可達1000個以上。,原理及技術(shù)要點 在一特制的分上下兩層的小盒，將趨化因子加入下室，待檢細胞加入上室，兩室用微孔濾膜分隔，37溫育數(shù)小時后，上室的中性粒細胞受下室趨化因子的吸引，由濾膜微孔進入濾膜內(nèi)，取濾膜清洗、固定、干燥、染色和透明，在高倍鏡下觀察細胞穿越濾膜的移動距離，從而判斷其趨化功能。

4、,濾膜滲透法,原理及技術(shù)要點 在瓊脂糖凝膠平板的中孔加白細胞懸液，左孔加趨化因子，右孔加對照液，溫育48小時后，用顯微鏡測微器測定中性粒細胞向左孔的移動距離A和向右孔的移動距離B，計算趨化指數(shù)。,趨化指數(shù)= A/B 趨化指數(shù)越大，表明中性粒細胞運動功能越強,瓊脂糖平板法,顯微鏡檢查法,吞噬指數(shù)=,（一）中性粒細胞吞噬功能檢測,NBT還原試驗,原理：,N-N- C + H+ N=N-R-,N-NH2 C N=NH,四氮唑基（淡黃色）,甲chan（紫黑色）,殺菌功能檢測,方法：,1.抗凝血 + 硝基藍四氮唑（NBT），37孵育25min。 2.推片染色、鏡檢。,正常值：,NBT陽性細胞率應(yīng)95%,

5、NBT還原試驗,炭粒廓清試驗 正常小鼠肝中枯否細胞可吞噬清除90炭粒，脾巨噬細胞約吞噬清除10炭粒。據(jù)此給小鼠靜脈注射定量印度墨汁（炭粒懸液），間隔一定時間反復取靜脈血，測定血中炭粒的濃度，根據(jù)血流中炭粒被廓清的速度，判斷巨噬細胞的功能。,（二）巨噬細胞功能檢測,M +CRBC,孵育,涂片、染色、鏡檢,計算、吞噬率、吞噬指數(shù),吞噬率（吞噬CRBC的M 數(shù)/計數(shù)的M 數(shù)）100,吞噬指數(shù) M吞噬的CRBC總數(shù)/計數(shù)的M 數(shù),吞噬功能檢測,返回章目錄,PBMC包括：淋巴細胞、單核細胞 各種血細胞比重不同,利用密度梯度離心進行分離 常用分層液：ficollhypaque，percoll,第二節(jié) 外周

6、血單個核細胞的分離和純化,外周血各細胞成分的密度,Ficoll分離液法是一種單次差速密度梯度離心的分離法，主要用于分離外周血中的單個核細胞。 原理： Ficoll分層液：密度1.0770.001 離心：密度梯度離心 分離：各類細胞按其相應(yīng)密度重新分布,一、Ficoll分離法,Ficoll分層液分離單個核細胞示意圖,Percoll分離單個核細胞示意圖,返回章目錄,紅細胞的去除：低滲裂解法、氯化銨裂解法 血小板的去除 ：胎牛血清梯度離心法 單核細胞的去除：黏附法 羰基鐵吞噬法（磁鐵吸引法） 苯丙氨酸甲酯去除法,第三節(jié) 淋巴細胞及其亞群的分離,一、淋巴細胞的純化,免疫磁珠分離法 流式細胞術(shù)分離法 其

7、他方法,二、淋巴細胞亞群的分離,原理 將針對淋巴細胞特殊表面標志的某種特異性單克隆抗體與磁珠結(jié)合形成免疫磁珠（IMB），當特異性單克隆抗體與表達相應(yīng)抗原的靶細胞結(jié)合，利用磁場可以將IMB所結(jié)合細胞與其他細胞分離。包被磁珠的抗體可以是第一抗體或第二抗體。,免疫磁珠分離法,免疫磁珠分離法,488 nm 激光,-,前向散射光 檢測器,熒光檢測器,電磁場,單個細胞被分類 進入檢測管,流式細胞術(shù)分離原理示意圖,E花環(huán)沉降法,T細胞功能檢測 B細胞功能檢測 NK細胞功能檢測,三、相關(guān)功能檢測,T細胞增殖試驗 T細胞介導的細胞毒試驗 MHC-肽四聚體技術(shù) 淋巴細胞內(nèi)細胞因子檢測,T細胞功能檢測,淋巴細胞,D

8、NA合成,分化,母細胞,刺激物,細胞變大 細胞漿擴大 空泡 核仁明顯 核染色質(zhì)疏松,T淋巴細胞增殖試驗,非特異性刺激物： PHA - T細胞 ConA - T細胞 PWM - T、 B細胞 LPS - B細胞 特異性刺激物： 異種抗原 同種組織抗原,淋巴細胞轉(zhuǎn)化的刺激物,形態(tài)學檢查法 3H-TdR摻入法 MTT比色法,淋巴細胞轉(zhuǎn)化的檢測方法,形態(tài)學檢查法,未轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化淋巴細胞的形態(tài)特征,原理：,刺激物,3756h,G1期 S1期,合成DNA,3H-TdR,3716h,DNA- 3H-TdR,測淋巴細胞內(nèi)放射量（cpm）,計算SI,判斷淋巴細胞轉(zhuǎn)化程度,外周血（T）G0期,3H-TdR摻入法,評

9、價：該方法敏感性高、客觀性強、重復性好、可自動操作；設(shè)備昂貴、放射污染。,刺激指數(shù)（stimulating index，SI ） SI=試驗管cpm均值/對照管cpm均值,3H-TdR摻入法,原理：,外周血T細胞,PHA,發(fā)生增殖,MTT,含藍色甲顆粒 的T細胞,MTT,PHA,有機溶劑,測吸光度（A）值,計算SI判定細胞增殖結(jié)果,SI=,(SI2具有意義),MTT比色法,原理:,靶細胞抗原,T細胞,觀察殺傷活力,致敏CTL,靶細胞,（三）T細胞介導的細胞毒試驗,試驗方法: 同位素法 淋巴細胞（CTL）+含51Cr 的腫瘤細胞 腫瘤細胞破壞 51Cr 釋放 測定射線,51Cr特異釋放率=,10

10、0%,（三）T細胞介導的細胞毒試驗,（三）T細胞介導的細胞毒試驗,背景無效應(yīng)細胞,效應(yīng)細胞/靶細胞 1:1,效應(yīng)細胞/靶細胞 5:1,效應(yīng)細胞/靶細胞 20:1,細胞溶解,MHC-肽四聚體技術(shù),原理 根據(jù)T細胞活化的雙識別原理，用生物工程技術(shù)將MHC分子在體外組裝，并結(jié)合抗原表位肽，形成抗原肽-MHC分子復合物，結(jié)合流式細胞儀定量檢測抗原特異性T細胞。,技術(shù)要點 : 1.在體外將特異性抗原肽段、可溶性MHCI類分子重鏈及2微球蛋白正確折疊，形成MHC-抗原肽復合物，并純化該復合物。 2.用生物素標記MHC-抗原肽復合物。 3.生物素標記的MHC-抗原肽復合物與熒光標記的親和素以4: 1的比例相

11、混合，即得到熒光標記的四聚體,MHC-肽四聚體技術(shù),MHC-肽四聚體技術(shù),原理: 用刺激劑體外激活淋巴細胞，用蛋白轉(zhuǎn)運抑制如莫能霉素阻止細胞因子分泌到細胞外，細胞內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運方式被打亂，引起細胞因子向高爾基體積聚，用流式細胞儀便可測出淋巴細胞內(nèi)的細胞因子種類，從而確定TH1/ TH2細胞的百分率。,淋巴細胞內(nèi)細胞因子檢測,Thl和Th2分泌的細胞因子,特異性抗原皮膚試驗 PHA皮膚試驗,體內(nèi)試驗,溶血空斑試驗 酶聯(lián)免疫斑點試驗 體內(nèi)試驗,B細胞功能檢測,溶血空斑試驗,溶血斑,補體,抗血清包被 綿羊紅細胞,酶聯(lián)免疫斑點法,抗體產(chǎn)生 B細胞,抗原包被,酶聯(lián)抗抗體,凝膠底物 顯色,刺激體內(nèi)抗體產(chǎn)生的特異性抗原有白喉類毒素、破傷風類毒素、多價肺炎鏈球菌等。 將適量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后1周、2周、