《酶分子修飾》課件.ppt

1、Chapter 6 Modification of Enzyme Molecule,第五章 酶的分子修飾,6.1 什么是酶分子修飾？,通過各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的催化特性的技術(shù)過程稱為酶分子修飾。 即：在體外將酶分子通過人工的方法與一些化學(xué)基團(tuán)（物質(zhì)），特別是具有生物相容性的物質(zhì)，進(jìn)行共價連接，從而改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。,酶分子修飾的意義,提高酶的活力 activity 增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性 stability 降低或消除酶的抗原性 immunological property 改變底物的專一性substrate specificity 研究和了解酶分子中主鏈、側(cè)鏈、組成單位、

2、金屬離子和各種物理因素對酶分子空間構(gòu)象的影響 structure,6.2 酶分子修飾的基本要求和條件,對酶分子進(jìn)行修飾必須在修飾原理、修飾劑和反應(yīng)條件的選擇以及酶學(xué)性質(zhì)等方面都要有足夠的了解。 （1）酶的穩(wěn)定性 熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、作用溫度、pH、抑制劑等。 （2）酶活性中心的狀況 活性中心基團(tuán)、輔因子等。其他如分子大小、性狀、亞基數(shù)等。,酶分子修飾的條件,修飾反應(yīng)盡可能在酶穩(wěn)定條件下進(jìn)行，并盡量不破壞酶活性功能的必需基團(tuán)，使修飾率高，同時酶的活力回收高。 （1）pH與離子強(qiáng)度 pH決定了酶蛋白分子中反應(yīng)基團(tuán)的解離狀態(tài)。由于它們的解離狀態(tài)不同，反應(yīng)性能也不同。 （2）修飾反應(yīng)的溫度與時間 嚴(yán)

3、格控制溫度和時間可以減少以至消除一些非專一性的修飾反應(yīng)。 （3）反應(yīng)體系中酶與修飾劑的比例,6.3 酶分子的修飾方法,金屬離子置換修飾, 大分子結(jié)合修飾(共價/非共價) 側(cè)鏈基團(tuán)修飾 肽鏈有限水解修飾 氨基酸置換修飾 酶分子的物理修飾,(1) 酶的金屬離子置換修飾,把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的修飾方法稱為金屬離子置換修飾,置換修飾的目的： 闡明金屬離子對酶催化作用的影響 提高酶的催化效率 增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性 改變酶的動力學(xué)特征,金屬離子置換修飾的過程,a. 酶的分離純化 b. 除去原有的金屬離子 c. 加入置換離子 金屬離子置換修飾只適用于那些在分子結(jié)構(gòu)中本來

4、含有金屬離子的酶。 用于金屬離子置換修飾的金屬離子，一般都是二價金屬離子。,(2) 酶的大分子修飾,采用水溶性大分子與酶的側(cè)鏈基團(tuán)共價結(jié)合，使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生改變,從而改變酶的催化特性的方法。 目的： 提高酶催化效率 增強(qiáng)穩(wěn)定性 降低或消除酶蛋白的抗原性,大分子修飾(共價)的過程,修飾劑的選擇,修飾劑的活化,修飾,分離,聚乙二醇是線性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在體內(nèi)無毒性、無殘留、無免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以與酶產(chǎn)生交聯(lián)，因而，它被廣泛用于酶的修飾。,(3) 酶分子的側(cè)鏈基團(tuán)修飾,采用一定的方法（一般為化學(xué)法）使酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生改變，從而改變酶分子的特性和

5、功能的修飾方法，稱為側(cè)鏈基團(tuán)修飾。 作用： 研究酶的分子結(jié)構(gòu)與功能 測定某一種基團(tuán)的數(shù)量 優(yōu)化酶的特性 獲得自然界不存在的新酶種,催化活性/非催化活性基團(tuán)的修飾,對非催化基團(tuán)修飾可改變酶的動力學(xué)性質(zhì)，改變酶對特殊底物的束縛能力。 經(jīng)常被修飾的殘基是： 親核的Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His 親電的Tyr、Trp 對催化活性基團(tuán)可以通過選擇性修飾側(cè)鏈成分來實(shí)現(xiàn)氨基酸的取代。,、氨基修飾,脫氨基作用：,共價結(jié)合：,凡能使側(cè)鏈氨基發(fā)生改變的化合物稱為氨基修飾劑，作用于側(cè)鏈的氨基發(fā)生脫氨基作用或與氨基共價結(jié)合將其屏蔽。,、羧基修飾,修飾劑與酶蛋白側(cè)鏈的羧基進(jìn)行酯化、?；确磻?yīng)，使構(gòu)象特

6、性發(fā)生變化。,例：,、巰基修飾,半胱氨酸殘基的側(cè)鏈含有巰基，多為活性中心，還可形成二硫鍵，有重要作用。,烷基化試劑修飾：,、基它修飾,胍基修飾：精氨酸側(cè)鏈，二羰基化合物與之生成穩(wěn)定雜環(huán) 咪唑基修飾：組氨酸側(cè)錠，酶活性中心的必需基團(tuán)。,酚基修飾：酪氨酸殘基 吲哚基修飾：色氨酸修飾，疏水性強(qiáng)，位于分子內(nèi)部，難修飾。,、分子內(nèi)交聯(lián)修飾,含雙功能基團(tuán)的化合物（雙功能試劑）與酶蛋白分子中相距較近的兩個側(cè)鏈基團(tuán)之間形成共價交聯(lián)，從而提高酶的穩(wěn)定性的修飾方法。 如：戊二醛、已二胺、葡聚糖二乙醛 戊二醛兩端都含有醛基，可以與酶分子中的氨基反應(yīng)形成酰胺鍵或者與羥基反應(yīng)形成酯鍵。 己二胺兩端都含有氨基，可以與酶分

7、子中的羧基反應(yīng)形成酰胺鍵。,酶蛋白的肽鏈被水解后，可能出現(xiàn)以下3種情況： （1）若肽鏈水解后引起酶活性中心的破壞，則酶將失去其催化功能。 （2）若將肽鏈的一部分水解后，仍可維持其活性中心的完整構(gòu)象，則酶的活力仍可保持或損失不多；但是其抗原性等特性將發(fā)生改變。 （3）肽鏈部分水解后，有利于活性中心與底物的結(jié)合并且形成準(zhǔn)確的催化部位的話，則酶可顯示出其催化功能或使酶活力提高。,(4) 酶蛋白主鏈修飾(肽鏈有限水解修飾),肽鏈的有限水解： 在肽鏈限定位點(diǎn)進(jìn)行水解，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變，從而改變酶的特性和功能的方法。,a、胃蛋白酶原的激活,b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活,藥

8、用酶的肽鏈有限水解修飾,大分子的蛋白質(zhì)往往具有較強(qiáng)的抗原性，而小分子的蛋白質(zhì)或肽段的抗原性較低或無抗原性；采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ姑阜肿拥碾逆溤谔囟ǖ奈稽c(diǎn)斷裂，其分子量減少，就可以在基本保持酶活力的同時使抗原性降低或消失。 如：木瓜蛋白酶用亮氨酸氨肽酶進(jìn)行有限水解，除去其肽鏈的2/3，該酶活力基本保持，其抗原性卻大大降低。,(5) 氨基酸置換修飾,將酶分子肽鏈上的某一個氨基酸換成另一個氨基酸的修飾方法。 作用： 可以提高酶活力 增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性 使酶的專一性發(fā)生改變,方法：,化學(xué)修飾法 Bender, Koshland成功地用化學(xué)方法將枯草桿菌蛋白酶活性中心的Ser變成Cys，修飾后酶對pr.和肽的水解

9、能力消失，卻出現(xiàn)了催化硝基苯酯等底物水解的活性。 但是化學(xué)修飾法難度大，成本高，專一性差，而且要對酶分子逐個進(jìn)行修飾，操作復(fù)雜，難以工業(yè)化生產(chǎn)。,定點(diǎn)突變技術(shù)（Site directed mutagenesis) 是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種基因操作技術(shù)。是指在DNA序列中的某一特定位點(diǎn)上進(jìn)行堿基的改變從而獲得突變基因的操作技術(shù)。是蛋白質(zhì)工程（Protein Engineering）和酶分子組成單位置換修飾中常用的技術(shù)。定點(diǎn)突變技術(shù)，為氨基酸或核苷酸的置換修飾提供了先進(jìn)、可靠、行之有效的手段。 是蛋白質(zhì)工程和酶分子組成單位置換修飾中的常用技術(shù),定點(diǎn)突變技術(shù)用于酶分子修飾的主要過程： （1）

10、新的酶分子結(jié)構(gòu)的設(shè)計 設(shè)計出獲得的新的酶RNA的核苷酸排列次序或酶蛋白的氨基酸排列次序，確定要置換的核苷酸或氨基酸及其位置。,（2）突變基因堿基序列的確定 根據(jù)酶蛋白的氨基酸排列次序（同義密碼） （3）突變基因的獲得 用DNA合成儀合成12個堿基被置換了的寡核苷酸，以寡核苷酸為引物通過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）或M13質(zhì)粒等定位突變技術(shù)獲得所需要的大量突變基因（寡核苷酸誘導(dǎo)的定位突變）,通過各種物理方法，使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的方法。 物理方法：高溫、高壓、高鹽、低溫、真空、失重、極端pH值、有毒環(huán)境。 極端條件,(6) 酶分子的物理修飾,目的：通過物理修飾，可

11、以了解不同物理?xiàng)l件下，特別是在極端條件下（高溫、高壓、高鹽、極端pH值等）由于酶分子空間構(gòu)象的改變而引起酶的特性和功能的變化情況。 特點(diǎn)：不改變酶的組成單位及其基團(tuán)，酶分子中的共價鍵不發(fā)生改變，只是在物理因素的作用下，副鍵發(fā)生某些變化和重排。,6.4 酶修飾后的性質(zhì)變化,熱穩(wěn)定性：一般來說，熱穩(wěn)定性有較大的提高。 抗原性：比較公認(rèn)的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比較明顯。 各類失活因子的抵抗力：修飾酶對蛋白酶、抑制劑均有一定的抵抗能力，從而提高其穩(wěn)定性。,半衰期：一般在體內(nèi)的半衰期得到有效延長。由于酶分子經(jīng)修飾后，增強(qiáng)對熱、蛋白酶、抑制劑等的穩(wěn)定性，從而延長了在體內(nèi)的半衰期。 最適pH：大部分酶經(jīng)化學(xué)修飾后，酶的最適pH發(fā)生了變化，這種變化在應(yīng)用研究上有時具有重要意義。修飾酶最適pH更接近于生理環(huán)境，在臨床應(yīng)用上有較