《蛋白質(zhì)工程設(shè)計》PPT課件.ppt

1、小組成員：雷文麗 李亞 劉苗,蛋白質(zhì)工程 第三節(jié) 天然蛋白質(zhì)的剪裁 第四節(jié) 全新蛋白質(zhì)設(shè)計,在分子設(shè)計的實踐中，常依據(jù)改造部位的多少將分子設(shè)計分為三類： 1定點突變或化學(xué)修飾法（小改） 置換、刪除或插入氨基酸，依賴分子生物技術(shù)，是目前最廣泛使用的方法 2拼接組裝設(shè)計法（中改） 當(dāng)前主要從基因水平上完成，又稱“分子裁剪” 3從頭設(shè)計全新蛋白質(zhì)（大改） 從基因水平上，或直接進(jìn)行化學(xué)全合成,第三節(jié) 天然蛋白質(zhì)的剪裁,分子剪裁：指在對天然蛋白質(zhì)的改造中替換1個肽段或1個結(jié)構(gòu)域。 方法： 1、將編碼一種蛋白質(zhì)的部分基因移植到另一種蛋白質(zhì)基因上 2、將不同蛋白質(zhì)基因的片段組合在一起，經(jīng)基因克隆和表達(dá)，產(chǎn)生

2、出新的融合蛋白質(zhì)。,應(yīng)用 1、嵌合抗體 利用基因工程的方法對鼠源單克隆抗體進(jìn)行改造使其人源化，鼠源抗體的V區(qū)與人源抗體的C區(qū)進(jìn)行拼接形成人-鼠嵌合抗體。 特點：減少了鼠源性抗體的免疫原型； 保留了親本抗體特異性結(jié)合抗原的能力。,2、人改型抗體 將鼠單抗的CDR移植到人單抗的骨架區(qū)。,結(jié)構(gòu)與功能的容忍度 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能對殘基的替換有一定的容忍度，即結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系有一定的穩(wěn)健度 Fersht等替換了Barnase的所有內(nèi)核殘基。結(jié)果表明23的突變體保留了酶的活性 Mathews及其合作者在溶菌酶內(nèi)核中替換多至10個殘基。實驗證明多重取代的蛋白仍具有活性以及協(xié)同折疊 這些結(jié)果說明不同的氨基序列具有

3、相近的設(shè)計的結(jié)構(gòu),第四節(jié) 蛋白質(zhì)分子的全新設(shè)計,全新蛋白質(zhì)設(shè)計：指基于對蛋白質(zhì)折疊規(guī)律的認(rèn)識，從氨基酸的序列出發(fā)，設(shè)計制造自然界不存在的全新蛋白質(zhì)使之具有特定的空間結(jié)構(gòu)和預(yù)期的功能。,蛋白質(zhì)全新設(shè)計流程,蛋白質(zhì)的全新設(shè)計內(nèi)容：,1）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設(shè)計-二級結(jié)構(gòu),2）蛋白質(zhì)功能的從頭設(shè)計-天然蛋白質(zhì)功能的模擬,根據(jù)穩(wěn)定不同類型蛋白質(zhì)的相互作用力來設(shè)計不同類型的蛋白質(zhì)，且已取得了明顯進(jìn)展，例如，離子通道納米管、血紅素結(jié)合蛋白、 氧化還原活性蛋白質(zhì)、DNA結(jié)合蛋白及基于蛋白質(zhì)的高分子材料。,蛋白質(zhì)從頭設(shè)計概念,從頭設(shè)計：根據(jù)生物分子的活性位點特征產(chǎn)生一系列的結(jié)構(gòu)片段，通過連接這些結(jié)構(gòu)片段可以構(gòu)成一

4、個全新分子；或者在結(jié)合腔內(nèi)對一個已知的結(jié)構(gòu)骨架進(jìn)行化合物的衍生化。,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的設(shè)計 1、二級結(jié)構(gòu)模塊單元的自組裝 2、配體誘導(dǎo)自組裝 3、通過共價交叉連接實肽的自組裝 4、在合成模板上肽的自組裝 5、線性多肽折疊為球狀結(jié)構(gòu) 6、基于基因庫的全新蛋白質(zhì)設(shè)計,一、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設(shè)計,中心問題：設(shè)計一個具有穩(wěn)定及獨特的三維結(jié)構(gòu)的序列 設(shè)計障礙：線性聚合鏈的構(gòu)象熵,要使一個序列能折疊為確定的三維結(jié)構(gòu)，設(shè)計的使用作用能必須超過構(gòu)象熵。 方法： 1）使相互作用的強(qiáng)度與數(shù)目達(dá)到最大（理論基礎(chǔ)：分析已知結(jié)構(gòu)的天然蛋白質(zhì)中的二級結(jié)構(gòu)單元） 2）通過共價交叉連接減小折疊的構(gòu)象熵,螺旋是通過氫鍵達(dá)到結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的，

5、單一螺旋在溶液中是穩(wěn)定的。 螺旋設(shè)計使用的策略有： 1）使用大的形成螺旋傾向性的殘基，如亮氨酸、谷氨酸或賴氨酸等 2）使用合適的集團(tuán)去除端基電荷，防止與螺旋偶極不合適的電荷相互作用 3）使用極化或荷電氨基酸引入穩(wěn)定的氫鍵或在螺旋中相隔一圈殘基間的離子相互作用 4）使用在螺旋中相隔一圈的殘基間疏水的（脂肪的或芳香的）范德華相互作用 5）使用芳香-荷電或芳香-硫的相互作用,螺旋：,1、二級結(jié)構(gòu)模塊單元的自組裝,最簡單、最直接的策略：合成單一二級結(jié)構(gòu)單元（螺旋或折疊股）作為多肽鏈的片段模塊途徑，復(fù)制這些二級結(jié)構(gòu)片段并把它們連接為整個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。 優(yōu)點：無論是從設(shè)計或合成看，都是簡單的；容易合成缺點：

6、蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性（熵較大，依賴濃度）；結(jié)構(gòu)的簡單重復(fù),兩條肽鏈自組裝為有序的二聚體結(jié)構(gòu),螺旋,最簡單的在自然界觀察得到的螺旋結(jié)構(gòu)是coiled-coil以及四螺旋束。,coiled-coil：Hodges及其合作者設(shè)計（周期性重復(fù)七肽）,四螺旋束,四螺旋束,coiled-coil和螺旋束差別： 共同之處：均為兩親性螺旋 不同點：coiled-coil含有一個狹窄的疏水面（疏水殘基主要在7肽序列a和d位置），而螺旋束含有較寬的疏水面,2、配體誘導(dǎo)組裝,使用一個配體（典型的是一個金屬離子）誘導(dǎo)模塊蛋白片段的組裝。,配體誘導(dǎo)組裝,3通過共價交叉連接實現(xiàn)肽的自組裝,設(shè)計全新蛋白的主要障礙是肽鏈的構(gòu)象熵。

7、當(dāng)幾個沒有連接的肽鏈進(jìn)行自助裝時，熵勢壘比較難以克服。通過共價交叉連接可以減少構(gòu)象熵。,被共價交叉連接所穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)的組裝,在自然界中唯一用于交叉連接的方法是二硫鍵。 在全新蛋白設(shè)計中也使用其他種類的交叉連接。例如Betabellin的設(shè)計中使用的DAB交叉連接方法，雖然DAB是二價的，但是DAB是非極性的，它會減少Betabellin在溶液中的溶解度，為此，二硫鍵連接代替DAB的交叉連接，得到Betabellin14D。,在合成模板上肽的組裝,是一種模板組裝合成蛋白方法，不使用天然蛋白中的turn和loops連接二級結(jié)構(gòu)單元，而是使用人工模板。同天然線性蛋白質(zhì)不同，螺旋和折疊股在一個特殊折疊過

8、程有一個正確的相對取向。 Mutter研究組使用的模板是寡肽，可形成兩個反平行折疊股，通過一個在一端的Pro-Gly轉(zhuǎn)折和一個在另一端的二硫鍵形成兩個反平行的折疊股，在鏈的兩端設(shè)計一個二硫鍵，形成一個環(huán)狀結(jié)構(gòu)。,5、線性多肽折疊為球狀結(jié)構(gòu) 不用模板或交叉連接而通過線性多肽折疊成球形的確定的三維結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)設(shè)計追求的目標(biāo)之一。 主要障礙：構(gòu)象熵 實例:-螺旋 根據(jù)-螺旋的兩親性。形成的-螺旋顯著穩(wěn)定性是因為形成明顯的疏水核，還有Glu 和Lys形成的鹽橋，螺旋偶極的電荷中和，增加了在螺旋/轉(zhuǎn)折連接處的柔性。,基于組合庫的全新蛋白質(zhì)設(shè)計,組合庫設(shè)計的核心問題：埋藏疏水部分 常用方法：基于極性（P）

9、和非極性（N）氨基酸的 “二元模式”，“二元模式”一方面要 有利于形成二級結(jié)構(gòu)，另一方面又要埋 藏疏水殘基。 應(yīng)用：二級結(jié)構(gòu)兩親片斷的構(gòu)建（一面完全是極性 殘基，另一面完全是非極性殘基）。,利用組合庫方法尋找全新蛋白質(zhì)已在如下方面取得成功：螺旋；折疊片；單體；自組裝為有序的排列；堆積為天然類蛋白質(zhì)；超熱穩(wěn)定性；結(jié)合輔因子的能力；催化活性。,二、蛋白質(zhì)的功能設(shè)計,蛋白質(zhì)設(shè)計的目標(biāo)是產(chǎn)生既能折疊為預(yù)想的結(jié)構(gòu)又具有有趣和有用的功能。功能設(shè)計主要涉及鍵合及催化，達(dá)到這一目的，可以采用兩條不同的途徑： 1、反向?qū)崿F(xiàn)蛋白質(zhì)與工程底物的契合，改變功能； 2、從頭設(shè)計功能蛋白質(zhì)。,蛋白質(zhì)的功能設(shè)計 通過反向擬

10、合天然蛋白質(zhì)設(shè)計新的功能 鍵合及催化的從頭設(shè)計 在全新蛋白質(zhì)中引入結(jié)合位點 催化活性蛋白質(zhì)的設(shè)計 膜蛋白及離子通道的設(shè)計 新材料的設(shè)計,通過反向擬合天然蛋白質(zhì)設(shè)計新的功能,執(zhí)行特別生物功能的天然蛋白質(zhì)能通過反向擬合獲得新的活性。通過修飾天然結(jié)構(gòu)得到專一性及活性改變的天然蛋白質(zhì)是可能的，目前在以下范圍已取得成功：DNA結(jié)合專一性；改變輔因子的專一性；改變底物的專一性。 反向擬合的能力大于僅僅改變專一性的修飾。事實上，它能把新奇的性質(zhì)附加到原蛋白質(zhì)骨架的結(jié)構(gòu)上。實例有： 1）引入金屬結(jié)合位點 2）位點專一DNA裂解,鍵合及催化的從頭設(shè)計,23個氨基酸自動折疊成的鋅指結(jié)構(gòu)（5）的核磁共振（NMR）結(jié)

11、構(gòu)(Struthers et al., 1996, 1998)； 5同源四聚體衍生物T2的X-射線結(jié)構(gòu)（Ali et al., 2004)； T2異源四聚體衍生物hetT1的X-射線結(jié)構(gòu) (Ali et al., 2005).,型異源四聚體的設(shè)計歷程,在全新蛋白質(zhì)中引入結(jié)合位點,全新蛋白質(zhì)設(shè)計除了能折疊為預(yù)想的結(jié)構(gòu)外，還要設(shè)計新的結(jié)合位點（金屬位點、血紅素結(jié)合位點等）及催化性質(zhì)。,新的金屬結(jié)合位點,催化活性蛋白質(zhì)的設(shè)計,這類設(shè)計的早期代表性工作是Chymohelizyme及Helichrome。兩個設(shè)計蛋白質(zhì)的催化位點與天然酶類似，在Chymohelizyme中設(shè)計的活性位點，是模擬胰凝乳蛋白

12、酶在Helichrome中的卟啉環(huán)類似于血紅素蛋白的活性位點。兩個設(shè)計均使用人工交叉連接預(yù)組織結(jié)構(gòu)并使活性口袋的位置接近催化活性部分。,后來又設(shè)計了人工脫羧酶（ART-OAD） 放置一個賴氨酸在兩親螺旋極面上并非常接近其他賴氨酸鏈，使中心的賴氨酸作親核試劑，支架上的賴氨酸是荷正電能與荷負(fù)電的底物成鍵。CD譜以及NMR譜研究表明，螺旋占優(yōu)勢。它的二級結(jié)構(gòu)依賴于濃度，表明兩親螺旋的組裝體為期望的多聚體（可能是四聚體）。它的Km（14mmol/L)類似于天然酶（Km=4mmol/L)。合成肽的Kcat（0.4min）比天然酶慢5個數(shù)量級但仍比脫羧反應(yīng)快900倍。,5、膜蛋白及離子通道的設(shè)計 一個全新膜蛋白從一個不溶于水的聚集體轉(zhuǎn)化為類似于膜的環(huán)境要求構(gòu)象變化。 Montal等設(shè)計了一系列模擬天然離子通道特征的全新蛋白質(zhì)，這些合成的微孔蛋白質(zhì)稱為Synporin，是使用Mntter的模板模擬方法。4條相同的23肽螺旋被固定在載體模板上，并且相互平行。,Synporin結(jié)構(gòu),CD譜研究結(jié)果表明，101個殘基的Synporin主要是螺旋。形成的離子通道具有如下特點：單通道；能區(qū)別不同的陽離子；在毫秒時間范圍內(nèi)打開與關(guān)閉；對局部麻醉通道阻塞劑是敏感的。 Lear等設(shè)計并合成了含有簡單兩親螺旋的離子通道，其具有的特點是：序列與天然離子通道序列不同；