血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)測定(賴氏法)

1、授課對象：06級檢驗1-5班 課 時：2學時血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）測定（賴氏法）目 標：1.掌握賴氏法測血清ALT的原理及注意事項 2.掌握試劑的配制熟練地制作標準曲線 3.規(guī)范地進行ALT測定 4.了解血清ALT測定的臨床意義實驗用品：配制試劑用的各種器皿（燒杯、容量瓶、電爐、分析天平等）、37水浴箱、 721型風光光度計、坐標紙等 原理：丙氨酸和-酮戊二酸在血ALT的作用下生成丙酮酸及谷氨酸，在酶反應達到規(guī)定時間時，加入2.4-二硝基苯肼-鹽酸溶液以終止反應。生成的丙酮酸與入2.4-二硝基苯肼作用，生成丙酮酸入2.4二硝基苯腙，苯腙在堿性條件下顯紅棕色。根據(jù)顯色之深淺，求得血清中丙

2、氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活力。試劑：1. 0.1molPH7.4磷酸鹽緩沖液 稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4 AR）11.928g,磷酸二氫鉀（KH2PO4 AR）2.176g，加少量蒸餾水溶解并稀釋至1000mL。2. ALP基質(zhì)液 稱取DL丙氨酸CHCH（NH）COOH1.79g，-酮戊二酸COOH（COCOOH）29.2mg于燒杯中，加入0.1mol/L PH7.4磷酸鹽緩沖液80mL,煮沸溶解后待冷，用摩爾NaOH溶液調(diào)節(jié)PH至7.4（約加入0.5ml），再用0.1mol/LPH7.4磷酸鹽緩沖液稀釋至100mL,混勻，加氯仿數(shù)滴，置冰箱保存數(shù)周。31mmol/L2.4-二硝基苯肼溶液 稱取2.

3、4-二硝基苯肼（NO）CHNHNH AR19.8mg，用10mol/L HC110mL溶解，然后加蒸餾水至100mL，置棕色瓶內(nèi)，冰箱保存。40.4mol/L NaOH溶液。52mmol/L丙酮酸標準液 精確稱取丙酮酸鈉CHCOCOONa AR22.0mg于100mL容量瓶中，加0.1mol/L PH7.4磷酸鹽緩沖液至刻度。此液應新鮮配制，不得久放。操作：血清ALT測定步驟（賴氏法）加入物（mL）RB血清0.10.1ALP基質(zhì)液0.5混勻，置37oC水浴30min2.4-二硝基苯肼0.50.5ALP基質(zhì)液0.5混勻，置37oC水浴20min0.4mol/L NaOH5.05.0將上述兩管混勻

4、，10min后，用蒸餾水調(diào)零，=505nm比色讀取各管吸光度值，用測定管A-對照管A，查標準曲線得ALT活力單位。血清ALT測定步驟（賴氏法）標準曲線制作：加入物（ml）0123452mmol/L丙酮酸標準液00.050.100.150.200.25ALP基質(zhì)液0.50.450.400.350.300.250.1mol pH7.4磷酸鹽緩沖液0.10.10.10.10.10.1混勻，置37oC水浴30min2.4-二硝基苯肼溶液0.50.50.50.50.50.5混勻，置37oC水浴20min0.4mol/L NaOH5.05.05.05.05.05.0相當于ALT單位028579715020

5、0混勻，10min后，用蒸餾水調(diào)零，=505nm比色讀取各管吸光度值，將各管之系光度減去0號管吸光度值后，以吸光度為縱坐標，各管相應的ALT單位為橫坐標，繪制標準曲線。結(jié)果報告：被檢者血清ALTU35U 報告者 年月日臨床意義：1賴氏法的酶活力單位是用卡門法所測出的酶活力單位相當于用本法所生成的丙酮酸量的相關(guān)系數(shù)套用卡門單位而來，卡門單位的定義：在規(guī)定表件下（血清1ml，反應液總量3ml，在25oC下作用1min，用內(nèi)徑1cm 的比色杯），測定340nm波長處吸光度減少值（A），每減少0.001為一個酶活力單位。2血清對照管吸光度基本相同，因此同一批標本只做23個血清對照管求其平均即可。亦可以空白管替代對照管。但脂血、溶血和黃疸血清應單獨做對照管。3. 測定結(jié)果超過200卡門單位時，應將血清稀釋后在進行測定，結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)。4. 酶測定中，溫度、時間對酶的活力影響很大，故應控制好測定時的溫度（要求準確到370.5oC），并準確掌握保溫時間。5. 配制底物液時，如改用改L型丙氨酸，則應按上法減半量用（因ALT只作用與L-型丙氨酸）。6. 丙酮酸鈉的純度，對曲線有明顯影響，純度低曲線斜率就低，使查得的酶活力單位顯著增高。故應選擇外觀潔白、干燥的丙酮酸鈉使用。7. 丙酮酸的顯色受溫度影響，故應于季節(jié)變化時及底物成份之批號更換時重新制作標準曲線。8于-酮戊二酸也能與2.4