核醫(yī)學(xué)課件：第五章 體外分析技術(shù)

1、第 五 章,體外標記免疫分析及受體放射分析,溫州醫(yī)科大學(xué)核醫(yī)學(xué)教研室 李煥斌,定義,以放射核素標記（或其他非放射性標記）的配體(Ligand)為示蹤劑，以配體和結(jié)合體的結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，在試管內(nèi)進行的微量生物活性物質(zhì)的檢測技術(shù)。,體外分析技術(shù)是結(jié)合了放射性核素的高靈敏度和特異性結(jié)合反應(yīng)的高特異性的一種超微量分析技術(shù)，具有靈敏度高、特異性強、精密度好、應(yīng)用面廣、方法簡便等優(yōu)點。,方法學(xué)基礎(chǔ),結(jié)合反應(yīng) 遵守可逆反應(yīng)的質(zhì)量作用定律： k1, v1 R+L RL k2, v2,定量手段,放射性測量技術(shù) 酶定量技術(shù) 化學(xué)發(fā)光定量技術(shù),生物學(xué)基礎(chǔ),特異性結(jié)合反應(yīng)： 抗原-抗體的免疫結(jié)合反應(yīng)； 配基-受體的結(jié)

2、合反應(yīng)； 底物-催化酶之間的酶促反應(yīng)； 結(jié)合體： 抗原-抗體 激素-激素結(jié)合球蛋白 受體-配體,體外分析技術(shù),體外放射分析,體外非放射分析,放射性競爭結(jié)合分析,放射性非競爭結(jié)合分析,放射免疫分析 (RIA),免疫放射分析,酶免疫分析,化學(xué)發(fā)光免疫分析,熒光免疫分析,(IRMA),(EIA),(CLIA),(FIA),第 一 節(jié),放射免疫分析法 (Radioimmunoassay),Dr. Yalow,在體外條件下, 利用Ag與定量的*Ag對限量的特異性Ab的競爭結(jié)合反應(yīng)，通過測定放射性復(fù)合物的量來計算出Ag 量的一種超微量分析技術(shù)。,一、基本原理,Ag-Ab + Ag,*Ag,Ab,Ag,+,

3、+,*Ag-Ab + *Ag,(B),(F),*Ag與Ag 免疫活性相同 *AgAg Ab,Ag= * Ag , AgAb=*AgAb,Ag *Ag , *AgAb (B) *Ag(F),Ag *Ag , *AgAb (B) *Ag (F),Ag,*Ag,Ab,*AgAb,AgAb,*Ag,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,Ag,25,50,100,200,400,800,*Ag,Ab,分離B、F,B%=B/(B+F),F%=F/(B+F),R=B/F,B1%,B2%,B3%,B4%,B5%,B6%,1,2,3,4,5,6,濃度,B%,標 準 曲

4、線,Ag,25,50,100,200,400,800,*Ag,Ab,分離B、F,B1%,B2%,B3%,B4%,B5%,B6%,1,2,3,4,5,6,B%,？,60,操作基本步驟,1.加樣：加樣總體積要保持一致，所處的介質(zhì)環(huán)境也要一致。 2.孵育：根據(jù)不同的分析對象孵育的溫度和時間不同，一般是37。 3.分離：選擇好的分離方法分離游離抗原和抗原抗體復(fù)合物。 4.測量：測量游離或結(jié)合物部分的放射性。 5.數(shù)據(jù)處理：繪制標準曲線和待測物濃度的計算。,二、基本方法, 基本試劑,1.抗體,2.標記抗原,3.非標記標準抗原（標準品）,2.標記抗原,1）比活度和放化純度足夠高,比活度每微克抗原上標記放射

5、性核素的千貝可數(shù)（KBq/g）,放化純度具有免疫活性的標記抗原占總放射性的百分數(shù)。 90%,2）半衰期足夠長，穩(wěn)定性好,3）保持原有抗原的特性,大分子：125I 小分子：3H or 125I,3.標準抗原 （標準品）,化學(xué)結(jié)構(gòu)、免疫活性與被測抗原相同,高純度, B和F的分離,1、第一類,2、第二類,雙抗體沉淀法,PEG沉淀法,固相第二抗體法,二、基本方法,+,Ag,Ab(1),Ab(2),Ab(2),Ab(1),Ag,可溶性復(fù)合物,可沉淀復(fù)合物,試管,試管,分離方法的要求,分離完全、快速。 不影響免疫反應(yīng)的平衡，即是要求在分離過程中不使抗原-抗體復(fù)合物解離或形成新的復(fù)合物。 受環(huán)境因素（溫度、

6、PH值等）的影響小。 操作簡便，分離劑來源豐富、價廉。,RIA 小 結(jié),靈敏度高 特異性好 精確的定量 方法操作簡便,第二節(jié) 免疫放射分析法,*Ab,+,Ag-*Ab + *Ab,（immunoradiometric assay,IRMA）,B%,Ag,（B）,（F）,在體外, 利用Ag與過量的*Ab的非競爭性結(jié)合反應(yīng)，通過測定放射性復(fù)合物的量來計算出Ag 量。標記抗體，抗體是過量的。,三、RIA與IRMA的比較 RIA IRMA 標記物 抗原 抗體 原理 競爭性結(jié)合 非競爭性 結(jié)合 抗體量 限量 過量 標準曲線 負相關(guān) 正相關(guān) 達到平衡的速度 慢 快 可測范圍 窄 寬 應(yīng)用對象 大分子、小分

7、子 大分子,IRMA和RIA低劑量區(qū)的不確定因素示意圖,非放射性標記免疫分析技術(shù),酶標記免疫分析技術(shù) 化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù) 時間分辨熒光免疫分析技術(shù),一、酶標記免疫分析技術(shù) 用酶分子代替放射性核素標記抗原或抗體，進行競爭性或非競爭性免疫分析的技術(shù)。其中應(yīng)用最多的就是酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）。 是結(jié)合了抗原抗體高特異性和酶促反應(yīng)的高敏感性的檢測技術(shù)。,ELISA方法是用酶分子標記抗體，進行與IRMA相似的夾心法免疫反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后分離結(jié)合部分和游離部分，利用結(jié)合部分上的酶分子的催化活性將底物轉(zhuǎn)化為特定的顏色，用分光光度計測定，顏色的深淺和酶量成正比，而酶量又和復(fù)合物的量成正比。 常用的酶

8、是辣根過氧化物酶，底物是四甲基聯(lián)苯胺 (TMB) ，反應(yīng)后顯黃色。,二、化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù) 化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)是以化學(xué)發(fā)光物質(zhì)代替放射性核素作為示蹤物的超微量分析技術(shù)。 化學(xué)發(fā)光物質(zhì)在氧化劑或催化劑的作用下能形成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物，并在退激時將能量轉(zhuǎn)化為光子的物質(zhì)。,1.化學(xué)發(fā)光免疫分析 是用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)作為標記物，標記抗原或抗體，反應(yīng)以后，利用堿性條件下化學(xué)發(fā)光物質(zhì)在氧化物作用下可以發(fā)生單光子放射。檢測光子的數(shù)量就可以反映復(fù)合物的量。 常用的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)是異魯米那和吖啶酯。,2.化學(xué)發(fā)光酶免疫分析 和ELISA相似，用堿性磷酸酶標記抗體，經(jīng)夾心法免疫反應(yīng)后，帶有酶的復(fù)合物作用于特殊的底物-金剛烷

9、，使底物發(fā)射出光子。 此法光子發(fā)射持續(xù)時間較長，可靠性比較好。,3.電化學(xué)發(fā)光免疫分析(略) 4.生物發(fā)光免疫分析(略),三、時間分辨熒光免疫分析技術(shù)（time-resolved fluoroimmunoassay）,時間分辨熒光免疫分析采用稀土元素標記抗體，利用時間分辨熒光儀特定的延遲時間測量，獲得稀土元素的特異熒光信號，同時消除非特異性熒光物質(zhì)的干擾。,標記物為具有獨特?zé)晒馓匦缘南⊥两饘勹|系元素,鑭系元素共有15種，應(yīng)用在時間分辨熒光免疫技術(shù)種有四種 : 釤（Sm），銪（Eu），鏑（Dy），鋱（Te） 鑭系元素?zé)晒庵匾攸c： 1. 極長的熒光衰退時間 銪：730000ns，釤：50000n

10、s，一般熒光物質(zhì)：10ns 2. 200nm的Stokes位移 銪：激發(fā)光340nm，發(fā)射光613nm 熒光素的Stokes位移為273nm 3. 狹窄的發(fā)射峰 4. 解離-增強技術(shù)可使其熒光性提高100萬倍,時間分辨熒光免疫分析技術(shù)（time-resolved fluoroimmunoassay）,一、基本原理,鑭系元素（15）：銪（Eu），釤（Sm），鏑（Dy），鋱（Te）,Eu,+,Eu,Eu,+,增強液,+,“解離增強鑭系熒光免疫分析”,二、TrFIA的特點,1. 最大限度提高測量方法的靈敏度 2. 有與RIA相似的特異性和精密度 3. 可同時測定兩種以上的抗原 4. 無輻射污染,總結(jié)： 體外分析的發(fā)展,方法設(shè)計的改變：競爭結(jié)合分析 非競爭結(jié)合分析，代表方法是免疫放射分析 標記物的改變：放射性核素 熒光、酶、化學(xué)發(fā)光、稀土元素 結(jié)合體的改變,微生物 RMA 酶 REA 受體 RRA 特異結(jié)合蛋白 CPBA 改變結(jié)合體對 放射性技術(shù) Ag Ag-Ab RIA + Ab 免疫學(xué)技術(shù) Ag Ag-Ab 改變標記物 第一階段 第二階段