菌落PCR實驗步驟

1、菌落PCR資料PCR, 菌落, 資料菌落PCR菌落PCR與我們通常的普通DNA的PCR的不同在于，直接以單個菌作為模板。是一種可以快速鑒定菌落是否為含目的質(zhì)粒的陽性菌落。操作簡單，快接，陽性率較高，在轉(zhuǎn)化鑒定中較常見。操作方法：1，挑取單個菌落，可以用高壓滅菌的牙簽。現(xiàn)在含抗性的平板上畫線，做保種用，然后置于20ultritonx100中攪和一下，將相應(yīng)的菌和板子上的畫線區(qū)做上對應(yīng)的記號2，將裝有20ulTritonx100的EP管100度煮2分鐘3，按照菌中預(yù)期包含的質(zhì)粒加好PCR體系，建議做20ul體系，模板加煮過的菌的上清1ul4，上機即可。退火溫度可以稍低，雖然沒有什么根據(jù)可言，但是個

2、人經(jīng)驗，推薦比質(zhì)粒PCR時稍低5，電泳，看結(jié)果，陽性的菌落對應(yīng)的板子可以直接挑菌小搖，保種或者送測序都可以 我的做法是：用槍頭挑選單菌落到裝有20uL水的pcr管中，然后懸浮菌液。在做PCR時，吸取1uL做摸板，但電泳檢測后，選有陽性克隆相對的菌液10uL與試管的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。這樣做， 既初步檢測了陽性克隆，又保存了所需要的菌落。當(dāng)然，在挑菌時也有用接種環(huán)挑的， 有用牙簽挑的， 看個人的愛好了我們都是直接拿牙簽挑單菌落往PCR反應(yīng)體系中攪拌一下，一般都能鑒定出來。想節(jié)省麻煩的話，還可以菌落鑒定同時挑單克隆，用1.5的EP管裝1mL左右培養(yǎng)基，牙簽挑出菌落后先在培養(yǎng)基上攪拌然后再放到PCR反

3、應(yīng)體系中。把PCR體系先加好，用接種針直接往菌落上戳一下然后伸到體系里面晃晃就可以上機P了，我每次都是這樣，可能是最方便的方法了。取200ul水，牙簽挑菌，煮沸5，冰浴5，12000rpm，取上清5ul做模版。其他的和普通pcr一樣。我們都是用過夜培養(yǎng)的菌液0.3ul（不要超過0.5ul）做模板，很簡單的，其它都不變。先94度5min 裂解菌，最好5min后再加入taq酶。 是的，菌落PCR不難。但是如果發(fā)現(xiàn)結(jié)果出現(xiàn)非特異帶，在目的帶位置有很弱的條帶出現(xiàn)，最好再用液體培養(yǎng)后再做一次PCR,我就因為這個陰性結(jié)果折騰了1個月。擴培后再作菌落PCR就得到陽性結(jié)果了。我是這樣做的,取菌液60ul至ep

4、管中,沸水中煮5min,離心,取其中上清1ul作模板,屢試不爽 拿牙簽點一下菌落然后再體系里面涮一下就可以了如果覺得不可靠，就索性接個種，搖個小管，然后取1ul作模板模板如果太多了，引物就不夠用了，顯然擴不出來，這種現(xiàn)象在質(zhì)粒這種模板的PCR里面很多，你提出來的質(zhì)粒不要忘記稀釋 一般來說, 菌落PCR能夠篩選陽性克隆. 象你的實驗中出現(xiàn)的這種假陽性結(jié)果, 也不是什么太反常的事情, 細菌本身的基因組也是反應(yīng)系統(tǒng)中的組分, 所以難免有些假陽性的結(jié)果. 建議多用幾對不同的引物擴增, 以增加真陽性篩選結(jié)果. 一般會出現(xiàn)假陽性，可能是粘在菌落上的目的基因被污染，建議引物一個為目的基因一個為載體上的，用無

5、菌牙簽挑取菌落，在配好的PCR體系中贊一下，PCR反應(yīng)條件為95度10分鐘94度40秒退火55度40秒72度1分鐘30個循環(huán)建議酶切后鑒定時同時取一個未做酶切的質(zhì)粒做對照，明確是否能切斷，再考慮是否能切出目的片段。假陽性并不高，可挑菌落搖菌12小時以上再取菌液pcr,初始變性溫度可設(shè)為98度。我們一般將接種好的菌液煮沸15min，4000rpm離心5min，用上清作模板，效果很好。 非常方便的方法,我做了不知多少次,從未失手.1.挑取菌落加入50ul dd水中,振搖.2.99度, 5滅活菌液中的酶3.12000rpm離心1去除細胞碎片4.取上清pcr,50ul體系取10ul 我做就是將菌株挑一

6、點點加入PCR體系中,涮一涮.我沒有煮沸和離心.剩下的菌落放到37度繼續(xù)讓它長大一些,方便接種.剛做的時候強烈建議大家要做陰性對照和陽性對照,因為有時候會有假陽性,即使陰性對照也會在目的位置出現(xiàn)條帶,只是亮度弱一些而已.我的經(jīng)驗是:若是真陽性,會很亮,讓你不會懷疑;如果似有似無,一般都是假陽性. 菌落PCR ，菌液PCR（菌液的體積不能過大，大了會影響PCR體系，導(dǎo)致擴增不出來，一般取0.3微升左右就行了）都可以的，一般10微升的PCR體系，跑樣時用小梳孔，（凝膠使用第一次時做回收用，將溴酚蘭及核酸以外的凝膠割下來，就可以再用來做鑒定膠了，一般鑒定用的舊膠用次都是可以的，比較節(jié)?。＠碚撋?，基

7、因特異性引物和載體上的通用引物都是可以的。最重要的是帶marker,先判斷大小。當(dāng)然最后還要提質(zhì)粒酶切鑒定一下。一般PCR陽性的菌，正確的可能性非常大。但也不排除PCR陽性，但酶切陰性的可能，因為如果基因是PCR后克隆到載體的，可能會存在堿基突變的可能。所以需要PCR和酶切兩種方法鑒定。但最終應(yīng)以測序的結(jié)果為準。 跑得很好的電泳：200v，我的目的片斷是400多pb，2%普通膠，跑了大概20分鐘左右吧菌落PCR很容易出現(xiàn)假陽性，可能與菌落本身的含量過于復(fù)雜所導(dǎo)致的1。用載體引物來作一般可以降低假陽性。2。菌落PCR作出來如果都是陽性或是陰性都不對，如果出現(xiàn)有的有，有的沒有，那么可以將其搖成菌液，作菌液PCR，或是