實(shí)驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定.ppt

1、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA ）,免疫學(xué)教研室,基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,抗原-抗體反應(yīng)的基本檢測(cè)方法,凝集反應(yīng)(agglutination):顆粒性抗原與抗體的反應(yīng)。,沉淀反應(yīng)(precipitation):可溶性抗原與抗體的反應(yīng)。,補(bǔ)體參與的反應(yīng),免疫標(biāo)記技術(shù)（immunolabelling technique）:用示蹤物質(zhì)標(biāo)記抗原或抗體，進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)的檢測(cè)。,基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,用示蹤物質(zhì)標(biāo)記抗體或抗原，使其與相應(yīng)的抗原或抗體反應(yīng)，使微量的、不可見的反應(yīng)成為可見的或可測(cè)定的。,免疫標(biāo)記技術(shù),基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研

2、室,用FITC-抗IgM單抗計(jì)數(shù)B細(xì)胞,免 疫 熒 光 技 術(shù),基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,課程內(nèi)容,ELISA的原理 ELISA的分類 間接ELISA的具體操作 ELISA在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用實(shí)例,基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,酶免疫測(cè)定(enzyme immunoassay, EIA),酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (enzyme linked immunosorbent assay，ELISA),原理：將抗原（抗體）固相化，與酶標(biāo)記的相應(yīng)抗體（抗原）結(jié)合后，加入該酶作用的底物，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進(jìn)行定性或定量分析。 方法：直接ELISA、間接ELISA、夾心ELIS

3、A、競(jìng)爭(zhēng)ELISA等,基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,ELISA的原理,1.抗原抗體反應(yīng)的特異性 2.抗原或抗體的固相化 3.抗原或抗體的酶標(biāo)記,E,基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,ELISA的分類,（一）直接法 （二）間接法 （三）雙抗體夾心法 （四）競(jìng)爭(zhēng)法,基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,直接ELISA,酶標(biāo)一抗,基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,間接法的原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測(cè)已與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。 其優(yōu)點(diǎn)在于只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法?？捎糜趥魅静〉脑\斷。,間接法（測(cè)抗體）,基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,夾心 （檢測(cè)抗原）,只要獲得針對(duì)受檢抗原的特異性抗體，就可用于

4、包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。,基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,競(jìng)爭(zhēng)抑制法 （檢測(cè)抗原） 待檢抗原與標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體。,小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定，可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模式。小分子激素、藥物等ELISA測(cè)定多用此法。,基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,標(biāo)準(zhǔn)HBcAg,wash,待檢HBcAb,當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時(shí)，可用此法檢測(cè)特異性抗體；如HBeAb， HBcAb；,基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,間接ELISA,實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簻y(cè)小鼠IgG免疫兔血清中

5、抗小鼠IgG抗體的效價(jià) 實(shí)驗(yàn)材料：包被抗原：小鼠血清 待檢抗體/一抗：兔抗小鼠IgG 酶標(biāo)抗體/二抗：HRP-驢抗兔IgG 聚苯乙烯酶標(biāo)板 水浴箱 移液器 槍頭 包被液：pH9.6的碳酸鹽緩沖液 封閉液/ 封：5%脫脂奶粉(ALB) 稀釋液/?。?pH7.4 0.05M的PBS （磷酸鹽緩沖液） 洗液：PBST（PBS+0.1%吐溫20） 顯色液：OPD（鄰苯二胺） 終止液/終：2M硫酸,基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,操作步驟,包被：正常小鼠血清（IgG）包被，100l/孔，4過夜 封閉：棄去包被液，加入5%脫脂奶粉封閉（ 200l/孔），37,20min 棄去封閉液，用洗滌緩沖液（PBS/Twee

6、n20）洗板3次 加入一抗：加入不同稀釋度的兔抗鼠IgG血清（ 100l/孔），以200起始，空白對(duì)照孔用洗液代替， 37,20min 洗板3次 加入酶標(biāo)二抗：加入HRP-驢抗兔抗體（ 100l/孔）， 37,20min 洗板3次 顯色：加入底物,100l/孔。室溫避光顯色5-10min; 2MH2SO4終止反應(yīng) 結(jié)果判定,間接ELISA,基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,E,E,終止液終止顯色,A,B兩排同樣操作，每孔加ul!,包被：1：5000稀釋的正常小鼠血清，4過夜,加酶標(biāo)抗體：1:5000稀釋的HRP標(biāo)記的驢抗兔IgG抗血清， 37 15min,加待檢抗體：倍比稀釋的兔抗鼠IgG抗血清，37

7、15min,洗滌：3次，1min/次,封閉：5%脫脂奶粉，37 20min,終止液50ul,空白對(duì)照無顯色,加底物液顯色,底物液100ul,洗滌：3次，1min/次,洗滌：3次，1min/次,基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,A,B排上樣完全相同：復(fù)孔,2-12號(hào)每孔00uL稀釋液， 號(hào)孔加入200uL一抗，從號(hào)孔吸取100uL加到號(hào)孔中，混勻，從號(hào)孔吸取100uL加到號(hào)孔中，混勻，號(hào)孔吸取uL，丟棄！ 每孔終體積100uL,無Ab, 僅稀釋液,基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,病原微生物及其抗體檢測(cè)如:肝炎病毒,SARS等,臨床疾病診斷中的應(yīng)用,蛋白質(zhì)測(cè)定:各種免疫球蛋白、補(bǔ)體、腫瘤標(biāo)記物,非肽類激素測(cè)定：T3

8、、T4，性激素測(cè)定, ,ELISA在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用,基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,ELISA在其他相關(guān)領(lǐng)域中的應(yīng)用,科研服務(wù),食品安全, ,環(huán)境衛(wèi)生,基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,DH2+ H2O2 D+ 2H2O DH2為供氫體， H2O2為受氫體。 DH2一般為無色化合物，經(jīng)酶作用后氧化成為有色的產(chǎn)物。,酶催化底物液顯色,E,基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,結(jié)果的判定,肉眼判定結(jié)果：于白色背景上直接肉眼觀察。顏色越深，反應(yīng)越強(qiáng)；陰性反應(yīng)為無色或極淺。根據(jù)顏色的深淺，以“”、“”表示。各組各人獨(dú)立觀察記錄。 測(cè)定A值：在酶標(biāo)儀上，根據(jù)不同底物設(shè)定波長（OPD底物為490nm，TMB底物為450nm），以空白孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值。以高于陰性對(duì)照孔OD值2倍為陽性。,基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,結(jié)果的判定,空白對(duì)照無顯色，而樣品顯色明顯且逐漸變淺,待檢樣品孔顯色明顯,空白對(duì)照,基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,定量方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線,待檢樣本,基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,注意事項(xiàng),對(duì)照的設(shè)定（陽性對(duì)照，陰性對(duì)照，空白對(duì)照） 倍比稀釋時(shí)，要正確操作；加樣時(shí)從低濃度向高濃度方向進(jìn)行 終止反應(yīng)的時(shí)間：以空白對(duì)照孔未顯色為準(zhǔn) 2M H2SO4具有腐蝕性，操作