食品中銅綠假單胞菌檢測

1、.,銅綠假單胞菌,.,一、概 述,銅綠假單胞菌（P. aeruginosa）俗稱綠膿桿菌，因為在代謝過程中產生水溶性的綠色色素，使傷口與創(chuàng)面呈綠色，故名綠膿桿菌。 銅綠假單胞菌能在許多污染物質中存活并繁殖，生長營養(yǎng)需求不高，善于利用各種碳源和氨化合物作為氮源，在水、土壤、食品以及醫(yī)院等環(huán)境廣泛存在，甚至在蒸餾水、消毒液也不例外，如季銨類消毒液，特別是含有一些有機物的液體。,.,銅綠假單胞菌可由多種途徑傳播，但主要是通過污染醫(yī)療器械、用具及帶菌醫(yī)護人員引起醫(yī)源性感染，因此，對燒傷病房、手術器械及治療器械應進行嚴格消毒滅菌，以保證無銅綠假單胞菌的污染。對銅綠假單胞菌感染的治療，可應用慶大霉素、多粘

2、菌素B和羧芐青霉素。 銅綠假單胞菌抵抗力較其他革蘭陰性菌強，561h可殺滅，對很多抗生素具有耐受性。對消毒劑、干燥、紫外線等理化因素及不良環(huán)境抵抗 力強，對化學藥物的抵抗力比一般革蘭氏陰性菌強大。,.,二、生物學特性 1. 培養(yǎng)特性 本菌屬于假單胞菌屬，是一種 非發(fā)酵革蘭陰性無芽孢桿菌，菌體 細長且長短不一，有時呈球桿狀或線狀，成對或 短鏈狀排列。菌體的一端有單鞭毛，在暗視野顯 微鏡或相差顯微鏡下觀察可見細菌運動活潑。 2菌體形態(tài) 無芽孢，無夾膜，革蘭陰性桿菌，有單鞭毛或叢鞭毛，運動活潑。菌體的大小為0.51m1.53.0m，菌體筆直或彎曲。,.,3、生化特性 氧化酶和過氧化氫酶陽性。O/F試

3、驗為氧化型，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，分解乙酰胺產生氨。 98 菌株產生水溶性熒光色素。銅綠假單胞菌能液化明膠，酪蛋白水解，但淀粉不水解。90 以上的菌株產生藍綠色色素。 分解蛋白質能力強，發(fā)酵糖類能力較低，氧化分解葡萄糖，產酸不產氣，不分解甘露醇、乳糖及蔗糖，能液化明膠，分解尿素，不形吲哚，氧化酶試驗陽性，還原硝酸鹽產氣，靛基質陰性，不產硫化氫。,.,三、致病性 主要致病物質是內毒素，此外尚有菌毛、莢膜、胞外 酶和外毒素等多種致病因子?？梢鹁植炕撔匝装Y ，也可引起中耳炎、角膜炎、尿道炎、胃腸炎、心內 膜炎 、膿胸，還可引起菌血癥、敗血癥及引起嬰兒嚴 重的流行性腹瀉。 WHO的HACCP評估明

4、確指出銅綠假單胞菌是嬰兒瓶裝 飲用水的危害指示菌，可造成嬰兒腹瀉。尤其是抵抗 力較差的老弱病幼孕人群，飲用含銅綠假單胞菌的瓶 裝水很可能導致疾病的發(fā)生，患者食入103104個菌體細 胞即可被侵害。銅綠假單胞菌的生長還將增加亞硝酸 鹽的含量-參考文獻。,.,國內外污染情況- 參考文獻 國內污染情況： -瓶裝天然礦泉水銅綠假單胞菌的檢出率1.223.6； -瓶裝飲用純凈水銅綠假單胞菌的檢出率11.6。 國外污染情況： -Richards等在104件檢品中的4件分離到銅綠假單胞菌； -Rosenberg報告德國1.210.2的瓶裝礦泉水檢出銅 綠假單胞菌。 剛出廠的產品中銅綠假單胞菌數(shù)量較少，但有文

5、獻報 道5加侖桶裝產品（1531天的保存期），銅綠假單胞 菌可生長繁殖達到 CFU/ml。 國內衛(wèi)生標準：0 CFU/250ml,.,三、實驗室檢驗,GB/T 8538-2008銅綠假單胞菌檢測（濾膜法）,.,原 理 將250mL水樣用孔徑為0.45m的濾膜過濾， 并將濾膜移至CN瓊脂培養(yǎng)基上，于36士1恒 溫箱中培養(yǎng)48h，能夠在CN瓊脂上生長并產生綠 膿菌素，或者能夠在CN瓊脂上生長并且氧化酶呈 陽性、紫外光（36020nm）照射下能發(fā)熒光、 能夠利用乙酰胺產氨的革蘭氏陰性無芽孢桿菌， 經證實為銅綠假單胞菌，則其檢測結果為陽性。,.,培養(yǎng)基和試劑 假單胞菌瓊脂基礎培養(yǎng)基/CN瓊脂（低溫避光

6、保存） 金氏B 培養(yǎng)基（低溫避光保存） 乙酰胺肉湯 營養(yǎng)瓊脂 氧化酶試劑 鈉氏試劑（配制好之后低溫避光保存）,.,設備和儀器 玻璃器具：所有玻璃器皿使用前需121高壓蒸汽滅菌15分鐘 恒溫培養(yǎng)箱：361 紫外燈：波長應為36020nm 濾膜：直徑47mm，微孔徑為0.45 （處理方法：如濾膜未經滅菌，則使用前需先將濾膜放入燒杯中，加入蒸餾水，置于沸水浴中煮沸滅菌3次，每次15 min。前兩次煮沸后需更換水，用蒸餾水洗滌2次3次，以除去殘留溶劑。建議使用一次性無菌濾膜。） 顯微鏡：10100 冰箱：08,.,.,.,操作步驟-水樣過濾 在100級的潔凈工作臺進行過濾操作。 首先用無菌鑷子夾取滅菌

7、濾膜邊緣部分， 將粗糙面向上，貼放在已滅菌的濾床上， 固定好濾器，將250mL水樣或稀釋液通 過孔徑0.45m的濾膜過濾，然后將過濾 后的濾膜貼在已制備好的CN瓊脂平板上， 平鋪并避免在濾膜和培養(yǎng)基之間夾留著 氣泡。,.,.,.,結果觀察 培養(yǎng)20h24h觀察濾膜上菌落的生長 情況并計數(shù)，防止因為培養(yǎng)導致菌落過分 生長而出現(xiàn)菌落融合。（ 40h48h時更 容易觀察產色素情況和熒光情況）。,.,.,.,.,可疑菌落計數(shù)情況 計數(shù)所有顯藍色或綠色（綠膿色素）的菌落，初步判定為銅綠假單胞菌。 計數(shù)濾膜上所有發(fā)熒光不產綠膿色素疑似銅綠假單胞菌菌落，并進行乙酰胺肉湯確定試驗。 （在紫外線下檢查濾膜時，應

8、避免長時間在紫外光下照射，否則可能會將平板上的菌落殺滅，而導致無法在證實培養(yǎng)基上生長。） 將其它所有紅褐色不發(fā)熒光的菌落進行氧化酶試驗、乙酰胺肉湯、金氏B培養(yǎng)基確證實驗。,.,.,純 化 營養(yǎng)瓊脂：將需驗證的可疑菌落劃線接 種營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，于361培養(yǎng) 20h24h，對可疑菌進行純化。,.,.,將最初顯紅褐色的菌落進行氧化酶試驗 氧化酶試驗 ： 原理：氧化酶（細胞色素氧化酶）是細胞色素呼吸酶系統(tǒng)的最終呼吸酶。具有氧化酶的細菌，首先使細胞色素C氧化，再由氧化型細胞色素C使對苯二胺氧化，生成有色的醌類化合物。 操作：取23滴新鮮配制的氧化酶試劑滴到放于平皿里的潔凈濾紙上。用鉑金絲接種環(huán)或玻璃棒，

9、將適量的純種培養(yǎng)物涂布在預備好的濾紙上。在10秒內顯深藍紫色的視為陽性反應。也可以按照商品化氧化酶測試產品的說明書進行該項測試。,.,產氨實驗（乙酰胺肉湯） 原理：銅綠假單胞菌產生一種脫酰胺酶，可使乙酰胺經脫酰胺作用釋放氨，滴加鈉氏試劑（碘化汞鉀），氨在堿性條件下與碘化汞鉀作用，生成紅色的絡合物。 操作：將純培養(yǎng)物接種到裝有乙酰胺肉湯的試管中，在361下培養(yǎng)20h24h。然后向每支試管培養(yǎng)物加入12滴鈉氏試劑，檢查各試管的產氨情況，如表現(xiàn)出從深黃色到磚紅色的顏色變化，則為陽性結果，否則為陰性。,.,.,產熒光素實驗（金氏B培養(yǎng)基） 原理：蛋白胨提供氮源，磷酸鹽促進熒光素的產生并抑制綠膿色素的產

10、生，硫酸鎂為熒光素的產生提供必須的陽離子，瓊脂是培養(yǎng)基的凝固。 操作：將上述呈紅褐色的且氧化酶反應呈陽性的培養(yǎng)物接種于金氏B培養(yǎng)基上，于361恒溫箱培養(yǎng)24h5d。 每天需取出在紫外燈下檢查其是否產生熒光性，將5d內產生熒光的菌落記錄為陽性。,.,.,計數(shù)結果說明 菌落計數(shù)公式： NPF(cF/nF)R(cR/nR) P是呈藍/綠色的菌落數(shù)（所有證實為銅綠假單胞菌的菌落）。 F是沒有綠膿色素但顯熒光的菌落數(shù)。 R是呈紅褐色的菌落數(shù)。 nF是進行產氨測試的顯熒光菌落數(shù)。 cF是產氨陽性的顯熒光菌落數(shù)。 nR是進行產氨、氧化酶、金氏B培養(yǎng)基上顯熒光測試的紅褐色菌落數(shù)。 cR是產氨、氧化酶、金氏B培養(yǎng)基上顯熒光測試均呈陽性的紅褐色菌落數(shù)。,.,舉 例 N=17+16(2/5)+10(3/5) 17：呈藍/綠色的菌落數(shù)； 16：沒有綠膿色素但顯熒光的菌落數(shù)； 2：產氨陽性的顯熒光菌落數(shù)； 5：進行產氨測試的顯熒光菌落數(shù)； 10：呈紅褐色的菌落數(shù)； 3：產氨、氧化酶、金氏B培養(yǎng)基上顯熒光測試均呈陽性的紅褐色菌落數(shù)； 5：進行產氨、氧化酶、金氏B培養(yǎng)基上顯熒