基因克隆及功能分析.ppt

1、高級分子生物學技術(shù),濟南大學 生物科學與技術(shù)學院 秦余香(一）分子生物學定義,從分子水平研究生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能從而闡明生命現(xiàn)象本質(zhì)的科學 ，主要指遺傳信息的傳遞（復制）、保持（損傷和修復）、基因的表達（轉(zhuǎn)錄和翻譯）與調(diào)控。,一、緒論,（二）分子生物學的主要研究內(nèi)容,DNA重組技術(shù),基因表達調(diào)控研究,生物大分子結(jié)構(gòu)與功能的研究,基因組、功能基因組與生物信息學研究,3,狹義上講，基因工程是指基因與載體在體外的拼接，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體內(nèi)，進行遺傳并表達出新的性狀。又稱DNA重組技術(shù)。 廣義上講，基因工程是指重組DNA技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化，包括上游技術(shù)和下游技術(shù)兩大組成部分。上

2、游技術(shù)指的是基因重組、克隆和表達的設(shè)計與構(gòu)建（即重組DNA技術(shù)）；而下游技術(shù)則涉及到基因工程菌或細胞的大規(guī)模培養(yǎng)以及基因產(chǎn)物的分離純化過程。,（三）基因工程（與分子生物學的區(qū)別）,(四）、分子生物學的應用,1、機理研究 2、生活實踐,珠蛋白的DNA探針 鐮刀狀細胞貧血癥,基因診斷,鐮刀狀細胞貧血癥,Leptin基因,Mice without the leptin gene are morbidly obese (right) compared to normal mice (left).,1994年，美國Rockfeller大學研究開發(fā)的肥胖相關(guān)基因Leptin 以2000萬美元轉(zhuǎn)讓給Amge

3、n公司。,Effects of recombinant human leptin treatment in a child with leptin deficiency.,（五）授課內(nèi)容,基因結(jié)構(gòu)、克隆和功能分析,基因克隆,正向遺傳學：由表型到基因 反向遺傳學：由基因到表型,如何獲得已測序物種的相關(guān)基因,Whole genome sequencing has now become routine,科研機構(gòu)及網(wǎng)絡(luò)資源中心,NCBI：美國國立衛(wèi)生研究院NIH下屬國立生物技術(shù)信息中心NCBI。 EMBnet：歐洲分子生物學網(wǎng)絡(luò)http:/www.e

4、/ EMBL-EBI：歐洲分子生物學實驗室下屬歐洲生物信息學研究所。 http:/www.ebi.ac.uk/ ExPASy: (Expert Protein Analysis System)瑞士生物信息研究所SIB下屬的蛋白質(zhì)分析專家系統(tǒng)； /,國內(nèi)生物信息中心舉例,CBIPKU：北京大學生物信息中心 BioSino：中國生物信息 / 中國科學院上海生命科學院生物信息中心 上海生物信息技術(shù)研究中心 /,Nucleic acid sequence datab

5、ases,Protein sequence databases,代表性的基因組學數(shù)據(jù)庫有： 人類基因組數(shù)據(jù)庫GDB 中國水稻基因組數(shù)據(jù)庫 NCBI基因組數(shù)據(jù)庫Genome ,Genome databases,NCBI,概述 Entrez檢索平臺 GenBank Pubmed(PubMed/GoPubMed) Blast,如何根據(jù)已知物種的基因獲得目的物種的基因片段,Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE),RACE 是采用PCR 技術(shù)由已知的部分cDNA 順序來擴增出完

6、整cDNA5和3末端,是一種簡便而有效的方法, 又被稱為錨定 PCR (anchored PCR)和單邊PCR(one side PCR)。,3 RACE-PCR,3 RACE takes advantage of the natural poly(A) tail found in mRNA as a generic priming site for PCR. In this procedure, mRNAs are converted into cDNA using reverse transcriptase (RT) and an oligo-dT adapter primer. Spec

7、ific cDNA is then amplified by PCR using a gene-specific primer (GSP) that anneals to a region of known exon sequences and an adapter primer that targets the poly(A) tail region. This permits the capture of unknown 3-mRNA sequences that lie between the exon and the poly(A) tail.,5-RACE,The 5 RACE Sy

8、stem is a set of prequalified reagents intended for synthesis of first strand cDNA, purification of first strand products, homopolymeric tailing, and preparation of target cDNA for subsequent amplification by PCR.,蛋白質(zhì)序列比對,蒺藜苜蓿的LOL1屬于ARGONAUTE家族，是擬南芥ARGONAUTE7的同源基因，在TAS3 ta-siRNA途徑中起關(guān)鍵作用,基因的功能分析,轉(zhuǎn)基因小

9、鼠和基因敲除小鼠是當前研究基因功能最常用的動物模型；植物模型為轉(zhuǎn)基因擬南芥或水稻及其突變體庫。目的載體的構(gòu)建轉(zhuǎn)基因操作轉(zhuǎn)基因陽性系鑒定及基因功能研究,轉(zhuǎn)基因技術(shù),酶切連接的方法構(gòu)建載體,超表達 pCAMBIA2300S 啟動子 pBIN m-gfp5-ER和pBI121,目的載體的構(gòu)建,ACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGAGACCCCCCCCCGCCAAGAAAGTCTGAAGAAAGCACCGATCAAAAGAGCTACCACAAATCAATCGCTCACCCTTC

10、CGCTTCCAACACTAATCAAATCGTCGATTCCTTCCACCAGCAGCTCGAATCCCCATCAACAATGTCGCTGATCCGCCGCAGCAACGTGTTCGACCCCTTCTCCCTCGACTTCTTCGACCCTTTTGACGGCTTCCCCTTCGGCTCCGGCAGCAGCAACAGCGGCGGCAGCCTCGTCCCGCGCACCTCCTCCGACACGGCGGCCTTCGCGGGCGCGCGCATCGACTGGAAGGAGACGCCCGAGGCGCACGTGTTCAAGGCGGACGTCCCCGGGCTGAAGAAGGAGGAGGTGAAGGTGGAGGT

11、GGAGGACGGCAACATCCTCCAGATCAGCGGCGAGCGGAACAAGGAGCAGGAGGAGAAGACCGACACCTGGCACAGGGTGGAGCGCAGCAGCGGCAAGTTCCTCCGCAGGTTCCGGCTCCCGGAGAACGCCAAGGCGGAGCAGGTGAAGGCGTCGATGGAGAACGGCGTGCTCACCGTCACCGTGCCCAAGGAGGAGGCCAAGAAGCCCGACGTCAAGTCCATCCAGATCTCCGGCTAGGCGTCTGCGTGCTCGCTGCGCGATGAGGTGGACTGCAGAGCAGAGGTGTGGAGTTTCGCCCC

12、GGTGGTAGTGATGAAATTAAAAAAAACCAGAGTCCGGCTGTCCGTGCGTGCGCTGTGTGTCTAGTACTCTAGCGTTGTGTGCGAATAAATCTCGTCTGTGTTTCCAATCCAGCACTCAATAATGA,ACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGAGACCCCCCCCCGCCAAGAAAGTCTGAAGAAAGCACCGATCAAAAGAGCTACCACAAATCAATCGCTCACCCTTCCGCTTCCAACACTAATCA

13、AATCGTCGATTCCTTCCACCAGCAGCTCGAATCCCCATCAACAATGTCGCTGATCCGCCGCAGCAACGTGTTCGACCCCTTCTCCCTCGACTTCTTCGACCCTTTTGACGGCTTCCCCTTCGGCTCCGGCAGCAGCAACAGCGGCGGCAGCCTCGTCCCGCGCACCTCCTCCGACACGGCGGCCTTCGCGGGCGCGCGCATCGACTGGAAGGAGACGCCCGAGGCGCACGTGTTCAAGGCGGACGTCCCCGGGCTGAAGAAGGAGGAGGTGAAGGTGGAGGTGGAGGACGGCAACATCCT

14、CCAGATCAGCGGCGAGCGGAACAAGGAGCAGGAGGAGAAGACCGACACCTGGCACAGGGTGGAGCGCAGCAGCGGCAAGTTCCTCCGCAGGTTCCGGCTCCCGGAGAACGCCAAGGCGGAGCAGGTGAAGGCGTCGATGGAGAACGGCGTGCTCACCGTCACCGTGCCCAAGGAGGAGGCCAAGAAGCCCGACGTCAAGTCCATCCAGATCTCCGGCTAGGCGTCTGCGTGCTCGCTGCGCGATGAGGTGGACTGCAGAGCAGAGGTGTGGAGTTTCGCCCCGGTGGTAGTGATGAAATT

15、AAAAAAAACCAGAGTCCGGCTGTCCGTGCGTGCGCTGTGTGTCTAGTACTCTAGCGTTGTGTGCGAATAAATCTCGTCTGTGTTTCCAATCCAGCACTCAATAATGA,表達載體構(gòu)建 酶切位點的引入,8045:5-TCTAGACCCATCAACAATGTCGCTGATC-3(XbaI) 8043:5-GGTACCCTAGCCGGAGATCTGGATGGAC-3(KpnI),注意（1）應選擇目的序列里沒有的、載體多克隆位點中含有的限制性內(nèi)切酶。（2）酶切位點加在引物的5端,Gateway技術(shù)構(gòu)建載體,Gateway可以被視為一種克隆操作平臺：把目的基

16、因克隆到入門載體（Entry Vector）后，不用使用限制性內(nèi)切酶，只靠載體上已有的特定重組位點和重組酶，就可快速、高效地將目的基因克隆到目的載體（ Destination Vector）中。,其基本原理為：在Gateway系列的載體中，一般均包含兩個重組位點序列，而在兩者中間有一個大腸桿菌普通菌株的致死基因ccdB基因，克隆時沒有被切開的載體或者自身環(huán)化的載體在遺傳轉(zhuǎn)化后因帶有該致死基因，該大腸桿菌菌株不能生長，包含目的基因的載體因其ccdB基因已被目的基因替換，菌株才能正常生長繁殖。,無需DNA連接酶做連接，只需要在5端PCR引物上游設(shè)計上CACC四個堿基，TOPO酶即可將PCR產(chǎn)物進行

17、定向克隆到pENTR載體中作為gateway技術(shù)的入門載體,D-TOPO技術(shù),混合包含目的基因的入門克隆和合適的目的載體及Gateway LR Clonase酶，產(chǎn)生表達克隆。,LR clonase,Gateway技術(shù)產(chǎn)生的分子生物學基礎(chǔ),轉(zhuǎn)基因流程,轉(zhuǎn)基因流程,轉(zhuǎn)基因程序,基因過表達或互補分析,基因的亞細胞定位定位：蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)表達部位,正向遺傳學,基因的圖位克隆,圖位克隆的基本原理,功能基因在基因組中都有相對較穩(wěn)定的基因座，通過找到與目標性狀緊密連鎖的分子標記，在利用分子標記技術(shù)對目的基因精細定位的基礎(chǔ)上，由于某一物種全基因組序列的公布，我們可以得到已定位區(qū)段的候選基因，通過對候選基因進

18、行分析，確定目標基因，最后經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化試驗證實目的基因功能。,圖位克隆的步驟：,Primary mapping,Fine mapping,Candidate gene,Complementation test,Functional analysis,圖位克隆能實現(xiàn)，關(guān)鍵在于全基因組（Col-0生態(tài)型）測序計劃的完成和各種分子標記的發(fā)現(xiàn)。,開發(fā)新的標記： 新的SSR標記： InDel/Caps標記：將要開發(fā)標記的日本晴區(qū)段序列與93-11做一個blast，選取插入或者缺失比較大的位點設(shè)計引物。,Candidate gene,將最后精細定位區(qū)段在/cgi-bin/gbrowse/rice/ 中輸入定位區(qū)間的物理位置，即可顯示出候選基因。,找到候選基因后可對候選基因進行分析以排除非目標基因，可以通過比較擴增，測序，表達量檢測及目標性狀相關(guān)的生化和生理途徑等方法來排除。當然最后要說明問題的話就是構(gòu)建互補載體做一個互補驗證。,Complementation