質(zhì)粒擴(kuò)增、提取、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染等操作程序

1、質(zhì)粒擴(kuò)增、提取、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染等操作程序質(zhì)粒擴(kuò)增、提取、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染等操作程序；一、感受態(tài)細(xì)菌制備（CaCl2法）；1.從LB平板上挑取新活化的大腸桿菌單菌落，接種；2.取0.5ml上述振蕩過(guò)夜的菌液，轉(zhuǎn)入含50m；3.將培養(yǎng)液50ml分裝到4個(gè)10ml的離心管中；4.4條件下，4000r/min離心10分鐘，；5.每管加入預(yù)冷的0.1mol/lCaCl2溶液；6.冰上放置10min后，4條件下質(zhì)粒擴(kuò)增、提取、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染等操作程序一、感受態(tài)細(xì)菌制備（CaCl2法）1. 從LB平板上挑取新活化的大腸桿菌單菌落，接種于5ml不加Amp的LB培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)過(guò)夜（200r/min，至OD=1.5左右

2、）。2. 取0.5ml上述振蕩過(guò)夜的菌液，轉(zhuǎn)入含50ml的LB的三角燒瓶（1%）中，37條件下振蕩培養(yǎng)22.5小時(shí)左右（200r/min），使OD600達(dá)到0.20.4左右（100l測(cè)600nm時(shí)OD值）。3. 將培養(yǎng)液50ml分裝到4個(gè)10ml的離心管中，每管10ml，冰上放置10min，4. 4條件下，4000r/min離心10分鐘，棄上清。將離心管倒扣在吸水紙上，盡量倒盡管中的培養(yǎng)基。5. 每管加入預(yù)冷的0.1mol/l CaCl2溶液2ml，用槍輕輕吹打，重懸沉淀。轉(zhuǎn)移到一個(gè)離心管中，共8ml。6. 冰上放置10min后，4條件下，4000r/min離心10min。7. 沉淀用預(yù)冷的1

3、.6ml 含有15%甘油的0.1mol/l的CaCl2溶液懸浮。分裝成200l的小份，共8管（40ml變?yōu)?.6ml濃縮25倍），-70保存?zhèn)溆?。二、溶液的配?. LB培養(yǎng)基：1%蛋白胨（typtone）、0.5%酵母提取物（yeast extract）、1%NaCl，即10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化鈉溶解在950ml水中，用1mol/LNaOH調(diào)PH至7.0，在補(bǔ)足水至1L。高壓滅菌20分鐘備用。2. 0.1mol/l的CaCl2溶液：1.1g/100ml，稱取1.1g CaCl2，加入雙蒸水定容至100ml，濾膜過(guò)濾或高壓滅菌，分裝成10ml/小份，4保存。另取8.5ml+1.

4、5ml已滅菌甘油，甘油含量為15%甘油，分裝成1ml/小份（10份）4保存。3. 配置液體培養(yǎng)基時(shí)，高壓滅菌20min備用；4. 配置固體培養(yǎng)基時(shí)+（1.5g/100ml）瓊脂糖，然后高壓滅菌20min。取出后，稍冷卻，一個(gè)60mm的培養(yǎng)皿中加入約20ml培養(yǎng)基，無(wú)菌條件下鋪板。5. 選擇性培養(yǎng)基：培養(yǎng)基+（1.5g/100ml）瓊脂糖，然后高壓滅菌20min，取出后放于60OC水浴，保持60oc溫度加入100mg/ml的氨芐青霉素（Amp）即100ml LB加入100l Amp(Amp終濃度達(dá)到50g/ml），搖勻后鋪板（20ml/板）上蓋稍打開(kāi)，37度烘箱/室溫下放置干燥1-2天，封口膜包

5、裹后貯4保存?zhèn)溆谩Ｈ?、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化注意：取兩管感受態(tài)細(xì)胞：為空白對(duì)照，不加質(zhì)粒：加入質(zhì)粒；每管加入量：體積10l，DNA50ng；質(zhì)粒稀釋成0.02g/l；200l感受態(tài)細(xì)胞中加入2l濃度為0.02g/l質(zhì)粒。具體步驟：1. 取兩管感受態(tài)細(xì)胞冰上放置解凍，同時(shí)質(zhì)粒冰上解凍，開(kāi)啟水浴鍋42oc管空白對(duì)照，不加質(zhì)粒；管加入2l 0.02g/l的質(zhì)粒，混勻，冰上放置30min2. 42水浴90s，不搖3. 取出，置冰上2min，加入LB 300l，37，200r/min振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，復(fù)蘇細(xì)胞。同時(shí)將選擇性培養(yǎng)基置于室溫1小時(shí)。4. 取上述轉(zhuǎn)化菌液150l涂布在相應(yīng)的培養(yǎng)板上：不含Amp的培養(yǎng)板不含質(zhì)粒

6、菌液 含Amp的培養(yǎng)板a：不加質(zhì)粒菌液；b：加質(zhì)粒菌液 正面培養(yǎng)1h后，倒置培養(yǎng)過(guò)夜。5. 觀察菌落生長(zhǎng)情況，取含Amp培養(yǎng)板上加入含質(zhì)粒菌液后生長(zhǎng)的菌落，加入到5ml LB液體培養(yǎng)基中（加入Amp 5ul），37培養(yǎng)12h。6. 用含甘油30%的LB保存，-70 備用（甘油消毒、高壓滅菌）。四、質(zhì)粒提取1. 已轉(zhuǎn)化好質(zhì)粒的細(xì)菌加入到含有抗生素的LB培養(yǎng)液總共大概150ml在37恒溫箱中搖菌過(guò)夜。2. 將細(xì)菌分裝在4個(gè)50ml的離心管中，7000r/min，10分鐘離心，倒掉上清。同時(shí)取10mlP1溶液加入10l的酶抑制劑，備用。3. 在每個(gè)離心管中加入1mlP1：酶抑制劑（1：1），吹打懸浮

7、沉淀，然后將所有菌液集合到同一個(gè)離心管中。4. 加入5ml的P2溶液，輕柔的顛倒20次。放置4分鐘。一旦加入P2，應(yīng)立刻蓋上蓋子，以防酸化。Genomic DNA裂解物是粘性物，切勿將溶解時(shí)間超過(guò)5分鐘。5. 加入5ml的P3溶液，輕柔的顛倒20次。冰上孵育20分鐘。加入P3后，會(huì)產(chǎn)生蓬松的白色物質(zhì)，沉淀物變得不粘，沉淀物包括genomic DNA,Protein,細(xì)胞碎屑和SDS6. 13000r/min,30分鐘離心，將上清倒至蓋有一層紗布的吸附柱（Qiagen-tip100）中，吸附柱下放置一個(gè)裝廢液的飯盒。吸附柱使用前應(yīng)用約4ml的QBT平衡，上清液應(yīng)快速加入柱中，如果上清放置時(shí)間長(zhǎng)則

8、會(huì)變得混濁，系蛋白沉淀所致，須再次離心。7. 待滴完之后，加滿QC液洗去殘液，滴完后再重復(fù)一次。8. 用5mlQF液洗脫柱上的質(zhì)粒至10ml離心管中。9. 加入3.5ml異丙醇，顛倒混勻，13000r/min，30分鐘?？梢?jiàn)沉淀物，小心棄去上清。10. 加入1ml70%的乙醇，溶解沉淀后轉(zhuǎn)入1.5ml的appendorf管；再取1ml70%的乙醇，清洗管壁，轉(zhuǎn)入1.5ml的appendorf管。11. 14600r/min，20分鐘，棄上清，待乙醇蒸發(fā)后加入100lTE，再將兩管集合（酌量，若質(zhì)粒量比較多，可加入200l）。12. 取2l質(zhì)粒液至加有98l雙蒸水的0.5mlappendorf管，在紫外分光光度計(jì)上檢測(cè)質(zhì)粒濃度和純度。（純度參照：1.82.0）13. 剩余的質(zhì)粒標(biāo)記日期，質(zhì)粒種類，濃度放在-20冰箱保存，備用。五、細(xì)胞轉(zhuǎn)染1.細(xì)胞計(jì)數(shù)后按一定數(shù)量植入24孔板中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時(shí)，備用。2.根據(jù)轉(zhuǎn)染的孔數(shù)及每孔