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1、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果準(zhǔn)確性的 影響因素,1,一、試驗(yàn)誤差分析及改進(jìn)措施 鱟試劑質(zhì)量及靈敏度標(biāo)示值得的影響 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)及使用的影響 實(shí)驗(yàn)器皿的的影響 樣品成份及理化性質(zhì)的影響 實(shí)驗(yàn)員的影響 環(huán)境的影響,2,1 鱟試劑質(zhì)量及靈敏度標(biāo)示值得的影響 鱟試劑的質(zhì)量:抗干擾能力,穩(wěn)定性; 鱟試劑靈敏度標(biāo)示值的準(zhǔn)確性 。 鱟試劑靈敏度的誤差 是否用細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定? 標(biāo)示值是否準(zhǔn)確?,3,2 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品引起的誤差 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品種類(lèi) 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)誤差 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品操作誤差 細(xì)菌內(nèi)毒素單位表示誤差 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的錯(cuò)誤使用,4,1) 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品種類(lèi) 細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)
2、際標(biāo)準(zhǔn)品 細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品,5,2) 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)誤差 細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品與細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品之間或細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品與細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品之間的生物效價(jià)存在一定的誤差,用不同細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)核同一批鱟試劑靈敏度時(shí)可能存在一定的誤差。中國(guó)藥典要求“當(dāng)c在0.5-2(包括0.5和2)時(shí),方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查,并以標(biāo)示靈敏度為該批鱟試劑的靈敏度?!痹囼?yàn)結(jié)果只要在這合格范圍內(nèi)表示鱟試劑標(biāo)示靈敏度準(zhǔn)確。,6,3) 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品操作誤差,取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)一支,輕彈瓶壁,使粉末落入瓶底,再用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕,用75%酒精棉球擦拭后啟開(kāi),防止玻璃屑落入瓶
3、內(nèi)。,正確,(易折點(diǎn))錯(cuò)誤,7,注意:只能在安瓿的易折點(diǎn)上部開(kāi)啟內(nèi)毒素,不能沿易折點(diǎn)開(kāi)啟,防止振蕩過(guò)程中內(nèi)毒素粘在封口膜上。 只能取1ml的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水復(fù)溶細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品。 若使用的為細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品,可按其使用說(shuō)明書(shū)中的方法將其稀釋至規(guī)定濃度后分裝保存。若為細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品,為一次性使用。,8,4) 錯(cuò)誤使用 有部分客戶(hù)使用廠(chǎng)家生產(chǎn)的細(xì)菌內(nèi)毒素來(lái)復(fù)核鱟試劑的靈敏度,這是一種錯(cuò)誤行為,更有甚者使用廠(chǎng)家生產(chǎn)的細(xì)菌內(nèi)毒素來(lái)交叉復(fù)核鱟試劑的靈敏度,這是一種嚴(yán)重錯(cuò)誤行為。,9,3 實(shí)驗(yàn)器皿的影響 器皿的計(jì)量管理(校正) 器皿的選擇標(biāo)準(zhǔn) 器皿的正確處理,10,1) 器皿的選擇標(biāo)準(zhǔn) 鱟
4、試驗(yàn)對(duì)器皿的要求:刻度準(zhǔn)確;內(nèi)表面光滑;易于清理。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查實(shí)驗(yàn)不宜選用注射器,最好使用經(jīng)過(guò)校正的刻度玻璃吸管或吸嘴。注射器刻度不精確,內(nèi)壁磨沙面吸附內(nèi)毒素,而且要特別注意注射器針頭引入的鐵離子對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的干擾,故不宜選用注射器。,11,如果用量不大,使用頻率不高,建議大家選用本公司提供的一次性耗材。無(wú)熱原耗材是一種在此行業(yè)中被鑒定為無(wú)內(nèi)毒素和-葡聚糖污染的產(chǎn)品,其中包括, 無(wú)熱原試管、無(wú)熱原移液器吸頭。這些產(chǎn)品可以給您的工作帶來(lái)很大方便,另外,當(dāng)實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)誤差時(shí)可首先排除器皿方面的因素,很快分析判斷出誤差原因。,12,2) 器皿的正確處理 2005年版中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范278頁(yè)細(xì)菌內(nèi)
5、毒素檢查法“實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備”規(guī)定:“將被洗滌的玻璃器皿用洗滌劑和自來(lái)水洗凈并烘干水分后,置洗液中浸泡4小時(shí),取出將洗液瀝干,用自來(lái)水將殘余的洗液洗凈,再用蒸,13,餾水沖洗干燥后置適宜的密閉金屬容器中,迅速置烤箱中,除去玻璃器皿表面可能存在的外源性?xún)?nèi)毒素?!?應(yīng)該特別注意,該規(guī)程明確規(guī)定最后沖洗玻璃器皿必須“用蒸餾水沖洗,禁用純化水沖洗?!庇械目蛻?hù)使用反滲透制備的純化水沖洗試驗(yàn)用玻璃器皿,結(jié)果試驗(yàn)中所有的陽(yáng)性對(duì),14,照都為陰性,復(fù)核鱟試劑靈敏度時(shí)試驗(yàn)結(jié)果誤差較大,這主要是由于純化水和蒸餾水的質(zhì)量不同所造成的。因純化水中存在的陰陽(yáng)離子經(jīng)250高溫干烤不能完全被破壞,這時(shí)不同的離子就產(chǎn)生對(duì)鱟試劑酶反應(yīng)
6、抑制或增強(qiáng)的反應(yīng),為了保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和檢驗(yàn)報(bào)告的權(quán)威性,我們應(yīng)該嚴(yán)格遵守操作規(guī)程,用多效蒸餾水沖洗鱟試驗(yàn)用玻璃器皿。,15,4 樣品成份及理化性質(zhì)的影響 -葡聚糖樣物質(zhì)的影響 PH值的影響 金屬離子和弱酸陰離子的影響 藥物濃度的影響,16,1) -葡聚糖樣物質(zhì)的影響 常見(jiàn)現(xiàn)象:假陽(yáng)性。 鱟試劑的特異性系指在藥品、生物制品和血液制品中鱟試劑能準(zhǔn)確測(cè)出被測(cè)物質(zhì)內(nèi)毒素的能力,既不能造成樣品內(nèi)毒素的漏檢,也不能將其它物質(zhì)錯(cuò)判為內(nèi)毒素。,17,目前我公司研究證明,已知能與鱟試劑發(fā)生反應(yīng)的物質(zhì)有細(xì)菌內(nèi)毒素和-葡聚糖,而內(nèi)毒素反應(yīng)曲線(xiàn)為S型特征曲線(xiàn),-葡聚糖反應(yīng)曲線(xiàn)為經(jīng)過(guò)0點(diǎn)的斜線(xiàn)。鱟試劑的特異性差的
7、另一種表現(xiàn),是將其它物質(zhì)(如-葡聚糖)判定為內(nèi)毒素,錯(cuò)誤將合格藥品判為不合格,造成制藥廠(chǎng)直接經(jīng)濟(jì)損失。,18,鱟試劑反應(yīng)機(jī)理圖,19,判斷假陽(yáng)性的方法: 1、特異性鱟試劑法; 2、定量反應(yīng)曲線(xiàn)分析法; 3、家兔模擬試驗(yàn)法。,20,2) PH值對(duì)反應(yīng)速度的影響 常見(jiàn)現(xiàn)象:樣品陽(yáng)性不成立。 鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)的最適宜pH在6.5-8.0;pH 3 或10時(shí),酶活性受到抑制。,相對(duì)活力,PH,7.0,21,PH對(duì)反應(yīng)速度的影響: 影響酶原的激活; 影響酶分子的構(gòu)象,過(guò)高過(guò)低的PH會(huì)改變酶的活性中心的構(gòu)象,或甚至改變整個(gè)酶分子的機(jī)構(gòu)使其變性失活。,22,故鱟試驗(yàn)時(shí),供試品 pH 最好應(yīng)預(yù)調(diào)和6.5-8
8、.0 為好,必要時(shí)可用無(wú)內(nèi)毒素的 HCl 或NaOH 稀溶液調(diào)節(jié) pH 值。美國(guó)、日本藥局方以及中國(guó)藥典故2005版規(guī)定檢品必須調(diào)節(jié)PH值6.0-8.0。,23,3) 金屬離子和弱酸陰離子 離子對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定結(jié)果影響較大,一方面陽(yáng)離子如Fe3+、Al3+強(qiáng)度較大會(huì)引起內(nèi)毒素的聚集造成內(nèi)毒素局部濃度過(guò)高,同時(shí)還必須注意高價(jià)陽(yáng)離子(如Fe3+)的氧化性對(duì)鱟試劑酶反應(yīng)具有強(qiáng)抑制作用;重金屬離子如Ag+、Cu2+、Pb2+可以使蛋白質(zhì)變性而使酶失活;另一方面鱟試劑必須在二價(jià)陽(yáng)離子Ca2+、Mg2+的參與下才能被激活形成凝膠反應(yīng)。許多藥物因PH值10時(shí),其中的陰離子會(huì)吸收鱟試劑中的Ca2+、Mg2+離
9、子,使實(shí)驗(yàn)呈假陰性。,24,4) 藥物濃度 1、10%葡萄糖注射液 2、白蛋白、小牛血清 3、醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉 4、中藥類(lèi)注射液,25,5 實(shí)驗(yàn)員的影響 操作時(shí)嚴(yán)格按操作規(guī)程進(jìn)行,安瓿開(kāi)啟前應(yīng)先用酒精棉球擦拭曲頸部,用將頸部折斷,防止碎玻屑掉入安瓿內(nèi)。在鱟試劑的溶解、樣品的稀釋及加樣時(shí),取樣均應(yīng)準(zhǔn)確。如果一人獨(dú)立完成試驗(yàn),可先稀釋配制好內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液,然后開(kāi)啟復(fù)溶鱟試劑,最后加樣,盡可能縮短鱟試劑溶液暴露在空氣中的時(shí)間(最好控制在15分鐘內(nèi))。,26,6、環(huán)境的影響 保溫時(shí)間 保溫溫度 1)保溫溫度 將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成2,進(jìn)行鱟試驗(yàn),然后分別放置于25、28、31、34、37、41、43、46、49水浴保溫。實(shí)驗(yàn)中觀(guān)察到凝膠形成的速度隨著溫度的升高而加快,但到達(dá)49保溫90min也未出現(xiàn)凝膠。,27,從實(shí)驗(yàn)可以看出,溫度對(duì)鱟試劑的靈敏度影響很大,保溫溫度在2541之間,隨著溫度的升高,反應(yīng)速度也升高,41尚未達(dá)到反應(yīng)速度峰值,25 時(shí)反應(yīng)速度已相當(dāng)快;在4146之間,溫度對(duì)鱟試劑的靈敏度無(wú)明顯影響;達(dá)到49或更高溫度時(shí),隨溫度升高而使酶蛋白逐漸變性,則鱟試劑被破壞,反應(yīng)速度反而降低。,28,2)保溫時(shí)間 將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成2,進(jìn)行鱟試驗(yàn),37保溫,分別在10、20、30、40、50、70min時(shí)觀(guān)察,發(fā)現(xiàn)凝膠的形
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