光譜分析技術(shù)(好資料).ppt

1、光譜分析技術(shù),光學(xué)導(dǎo)論,光譜：復(fù)色光經(jīng)色散系統(tǒng)分光后，按波長(zhǎng) （或頻率）的大小依次排列的圖像,光學(xué)導(dǎo)論,基于測(cè)量物質(zhì)的光譜而建立起來(lái) 的分析方法稱為光譜分析法,吸收光譜,發(fā)射光譜,分子光譜,原子光譜,光學(xué)導(dǎo)論,吸收光譜,顏色的差異定性 顏色的深淺定量,光學(xué)導(dǎo)論,發(fā)射光譜,化學(xué)發(fā)光,熱/電激發(fā)發(fā)光,光致發(fā)光,光學(xué)導(dǎo)論,光譜分析法的準(zhǔn)確分類,分子光譜 吸收（根據(jù)吸收波段不同細(xì)分） 紫外-可見(jiàn) 紅外 發(fā)射（根據(jù)發(fā)射原理不同細(xì)分） 光致發(fā)光：熒光、磷光 化學(xué)發(fā)光,光學(xué)導(dǎo)論,光譜分析法的準(zhǔn)確分類,原子光譜 吸收 發(fā)射（根據(jù)發(fā)射原理不同細(xì)分） 熱/電激發(fā)發(fā)光：發(fā)射 光致發(fā)光：熒光,光學(xué)導(dǎo)論,光譜分析光學(xué)分

2、析！,光學(xué)分析 = 光譜分析 + 非光譜分析,非光譜分析：基于物質(zhì)與輻射的相互作用，測(cè)量輻射的某些性質(zhì)，如折射、散射、干涉、衍射和偏振等變化的分析方法,光學(xué)導(dǎo)論,光譜分析與非光譜分析的區(qū)別,光譜分析涉及“顏色”“譜”“能量”的變化 非光譜分析涉及光的傳播方向等物理性質(zhì)的變化，不涉及“譜”,光學(xué)導(dǎo)論,光的本質(zhì)：電磁輻射、波粒二象性,波,波長(zhǎng)、頻率、速度 = c (真空中的) = 3 108 ms-1,波長(zhǎng)：相鄰兩個(gè)波峰或波谷間的直線距離 單位可以是nm、m、cm、m 頻率：在1秒時(shí)間內(nèi)經(jīng)過(guò)某點(diǎn)的波數(shù) （即每秒內(nèi)振動(dòng)的次數(shù)） 單位Hz (s-1) 周期T：頻率的倒數(shù)；波數(shù)：波長(zhǎng)的倒數(shù),光學(xué)導(dǎo)論,射

3、線,x射線,紫外光,紅外光,微波,無(wú)線電波,10-2 nm 10 nm 102 nm 104 nm 0.1 cm 10cm 103 cm 105 cm,電磁波譜：將電磁輻射按照波長(zhǎng)或頻率的 大小順序排列起來(lái)即稱為電磁波譜,光學(xué)導(dǎo)論,光學(xué)導(dǎo)論,粒,光子：能量E、普朗克常數(shù)h、電子伏特eV h = 6.626 10-34 Js 1J = 6.241 1018 eV = h= hc/,當(dāng)物質(zhì)所吸收的電磁輻射能量能夠滿足 該物質(zhì)由低能態(tài)(基態(tài))躍遷至高能態(tài)(激發(fā)態(tài))， 將產(chǎn)生吸收光譜,當(dāng)物質(zhì)通過(guò)電、熱或光等激發(fā)至激發(fā)態(tài)， 再?gòu)募ぐl(fā)態(tài)過(guò)渡到低能態(tài)或基態(tài)時(shí)， 將產(chǎn)生發(fā)射光譜,吸收光譜,發(fā)射光譜,光學(xué)導(dǎo)論,

4、某分子的外層價(jià)電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài) 需要20 eV，請(qǐng)問(wèn)該分子吸收光的波長(zhǎng)？,解：1 eV = 1.602 10-19 J 根據(jù)公式= hc/ 則= hc/ = （6.626 10-34 3 108 ）/ （20 1.602 10-19 ） = 0.62 10-7 m = 62 nm,紫外-可見(jiàn)分光光度法,什么是紫外-可見(jiàn)光譜,遠(yuǎn)紫外光區(qū)：10200 nm 近紫外光區(qū)：200400 nm UVC：200280 nm UVB：280320 nm UVA：320400 nm 可見(jiàn)光區(qū)：400780 nm 紅外光區(qū)：780 nm1 mm,什么是紫外-可見(jiàn)分光光度法,基于分子外層價(jià)電子躍遷產(chǎn)生的在紫

5、外-可見(jiàn)光譜區(qū)的吸收光譜進(jìn)行分析的一種常用的光譜分析方法。 ultraviolet and visible (UV-vis) spectrophotometry,基本原理,分子的三種運(yùn)動(dòng)狀態(tài)對(duì)應(yīng)有一定的能級(jí)。即在分子中存在著： 電子能級(jí) 振動(dòng)能級(jí) 轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí) 這三種能級(jí)都是量子化的,分子能量的變化： E = Ee + Ev + Er Ee Ev Er,基本原理,基本原理,分子吸收光（電磁波）后產(chǎn)生的能量的變化：,遠(yuǎn)紅外光譜 （轉(zhuǎn)動(dòng)光譜）,中紅外光譜 （振動(dòng)光譜）,紫外-可見(jiàn)光譜 （電子光譜）,基本原理,帶狀光譜 發(fā)生電子躍遷時(shí)必然要發(fā)生振動(dòng)能級(jí)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)的躍遷，這使得紫外-可見(jiàn)吸收光譜呈現(xiàn)帶狀,

6、典型的紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖,吸收峰,最大吸收波長(zhǎng)(max),基本原理,價(jià)電子 電子 飽和的單鍵 電子 不飽和的雙鍵、三鍵 n電子 孤對(duì)電子 分子中分子軌道有成鍵軌道與反鍵軌道： 它們的能級(jí)高低為： n * *,*,*,n,非鍵軌道,反鍵軌道,反鍵軌道,成鍵軌道,成鍵軌道,*,n*,*,n*, ,1.* 躍遷： 飽和烴（ C-C，C-H ） 能量很高， 200nm 4. n*躍遷： 含雜原子不飽和基團(tuán)（C N ，C=O ） 能量最小， 200400nm,基本原理,影響紫外-可見(jiàn)吸收光譜的因素,1 共軛效應(yīng) 共軛體系越長(zhǎng)， 與*的能量差越小，紅移效應(yīng)和增色效應(yīng)越明顯。 2 立體化學(xué)效應(yīng) 空間位阻、

7、跨環(huán)效應(yīng) 3 溶劑的影響 溶劑效應(yīng) 4 體系pH的影響,Tips： 由于溶劑對(duì)電子光譜圖影響很大，因此，在吸收光譜圖上或數(shù)據(jù)表中必須注明所用的溶劑。與已知化合物紫外光譜作對(duì)照時(shí)也應(yīng)注明所用的溶劑是否相同。在進(jìn)行紫外光譜法分析時(shí)，必須正確選擇溶劑。,朗伯-比爾定律定量分析的基礎(chǔ),當(dāng)強(qiáng)度為I0的一定波長(zhǎng)的單色入射光束通過(guò)裝有均勻待測(cè)物的溶液介質(zhì)時(shí)，該光束將被部分吸收Ia，部分反射Ir ，余下的則通過(guò)待測(cè)物的溶液It ，即有： I0=Ia + It + Ir,朗伯-比爾定律,如果吸收介質(zhì)是溶液（測(cè)定中一般是溶液），式中反射光強(qiáng)度主要與器皿的性質(zhì)及溶液的性質(zhì)有關(guān)，在相同的測(cè)定條件下，這些因素是固定不變

8、的，并且反射光強(qiáng)度一般很小。所以可忽略不記，這樣： I0=Ia+ It,朗伯-比爾定律,透光率透光率表示透過(guò)光強(qiáng)度與入射光強(qiáng)度的比值，用T來(lái)表示，計(jì)算式為：T = It/I0 T常用百分比（%）表示。 吸光度透光率的倒數(shù)的對(duì)數(shù)叫吸光度。用A表示： A = -lgT = lg(I0/It),朗伯-比爾定律,當(dāng)用一束強(qiáng)度為I0的單色光垂直通過(guò)厚度為b、吸光物質(zhì)濃度為c的溶液時(shí)，溶液的吸光度正比于溶液的厚度b和溶液中吸光物質(zhì)的濃度c的乘積。,朗伯-比爾定律,Io,It,b,a,A = lg(I0/It) = Kbc,朗伯-比爾定律,吸光系數(shù)： 當(dāng)溶液濃度c的單位為g/L,溶液液層厚度b的單位為cm時(shí)

9、，K叫“吸光系數(shù)”，用a表示，其單位為L(zhǎng)g-1cm-1 摩爾吸光系數(shù)： 當(dāng)溶液濃度c的單位為mol/L，液層厚度b的單位為cm時(shí)，K叫“摩爾吸光系數(shù)”，用表示，其單位為L(zhǎng)mol-1cm-1 = aM (M為吸光物質(zhì)的分子量),工作原理基儀器結(jié)構(gòu)框圖,光源,碘鎢燈,氘燈,單色器,測(cè)量池,參比池,樣品池,光電倍增管,數(shù)據(jù)處理和儀器控制,紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì),紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì),單光束分光光度計(jì),雙光束分光光度計(jì),紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì),吸收池的材料,玻璃,360 nm,2.25 mm,紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì),石英,200 nm,2.5 mm,紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì),吸收池的形狀,紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì),

10、思考題,為什么紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)的最大吸收值只能到3或者5，超過(guò)該值便會(huì)造成數(shù)據(jù)溢出？,生物分子的紫外-可見(jiàn)吸收光譜,糖,紫外可見(jiàn)光譜在糖的分析中, 主要作定量檢測(cè)。最大吸收波長(zhǎng)為218 nm, 多糖最大吸收波長(zhǎng)為206 nm。,生物分子的紫外-可見(jiàn)吸收光譜,脂,脂 肪,230240 nm, 于有機(jī)溶劑中（如乙醇、正己烷等）,類 脂,維生素A,326 nm于乙醇,番茄紅素,番茄紅素在溶劑正己烷中的譜圖,番茄紅素在溶劑石油醚中的譜圖,生物分子的紫外-可見(jiàn)吸收光譜,生物分子的紫外-可見(jiàn)吸收光譜,蛋白質(zhì),Proteins in solution absorb ultraviolet light wi

11、th absorbance maxima at 280 and 200 nm. Amino acids with aromatic rings are the primary reason for the absorbance peak at 280 nm. Peptide bonds are primarily responsible for the peak at 200 nm.,酪氨酸,色氨酸,苯丙氨酸,生物分子的紫外-可見(jiàn)吸收光譜,核酸,嘌呤和嘧啶在250280 nm有強(qiáng)的吸收作用，綜合起來(lái)在260 nm吸收值最大。,Tips： 1. 吸收強(qiáng)度：?jiǎn)魏塑账?單鏈DNA 雙鏈DNA （增色

12、效應(yīng)、減色效應(yīng)） 2. A260/A2801.82.0，DNA較純 A260/A280 2.0，DNA樣品中含有RNA,微生物的紫外-可見(jiàn)吸收光譜,600 nm測(cè)細(xì)菌等微生物的濁度，用于估計(jì)細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。 比如，得到的OD600的數(shù)值如果在0.6-0.8之間，表明細(xì)菌處于旺盛生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，OD6003表明細(xì)菌已經(jīng)飽和等。,核酸蛋白測(cè)定儀,Eppendorf BioPhotometer plus,ELISA原理圖,固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）,酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）,酶作用的底物（顯色劑）,酶標(biāo)儀,酶標(biāo)儀,Tecan Infinite 200 Pro多功能酶標(biāo)儀,ELISA,分子熒

13、光光譜,什么是熒光光譜,某些物質(zhì)經(jīng)紫外-可見(jiàn)光照射后，能立即放出能量較低（亦即波長(zhǎng)較長(zhǎng)）的光光致發(fā)光。 當(dāng)照射停止后，如化合物的發(fā)射在10-9秒鐘內(nèi)停止，則稱熒光(fluorescence); 超過(guò)此限度即稱為磷光(phosphorescence)。,什么是熒光光譜,基本原理,Ee0,Ev0,Ev1,Ev2,Ev3,Ev4,Ee1,Ee2,熒光發(fā)射： 當(dāng)分子處于單重激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能層時(shí)， 去活化的一種形式是以10-910-7s左右的短時(shí)間 內(nèi)發(fā)射光子返回基態(tài)，這一過(guò)程稱為熒光發(fā)射。,激發(fā)光譜,激發(fā)光譜,固定熒光發(fā)射波長(zhǎng)，掃描激發(fā)波長(zhǎng),熒光激發(fā)光譜與紫外-可見(jiàn)吸收光譜類似，Why？,橫坐標(biāo)是入

14、射光（激發(fā)光）的波長(zhǎng)，縱坐標(biāo)是發(fā)射光（熒光）的強(qiáng)度,發(fā)射光譜,固定激發(fā)光波長(zhǎng)，掃描發(fā)射波長(zhǎng),橫坐標(biāo)是發(fā)射光（熒光）的波長(zhǎng)，縱坐標(biāo)是發(fā)射光（熒光）的強(qiáng)度,發(fā)射光譜(熒光光譜),2. 三維熒光光譜,I F f (ex 、em),蒽的激發(fā)光譜,固定發(fā)射波長(zhǎng)、掃描激發(fā)波長(zhǎng),I F f (ex 、em),蒽的發(fā)射光譜,固定激發(fā)波長(zhǎng)、掃描發(fā)射波長(zhǎng),蒽的三維等高線光譜圖,蒽的三維等熒光強(qiáng)度光譜,熒光量子產(chǎn)率（熒光效率）,kF為熒光發(fā)射過(guò)程的速率常數(shù)，取決于熒光物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)； Ki為其他過(guò)程（如振動(dòng)弛豫等）的速率常數(shù)總和，主要取決于化學(xué)環(huán)境，同時(shí)也與熒光物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。,熒光與有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu),1. *

15、 是有機(jī)化合物產(chǎn)生熒光的主要躍遷類型。,2. 產(chǎn)生熒光的有機(jī)物質(zhì)，都含有共軛雙鍵體系，共軛體系越大，熒光越容易產(chǎn)生。,產(chǎn)生熒光的條件,熒光物質(zhì)的剛性和平面性增加， 有利于熒光發(fā)射。,3. 剛性平面結(jié)構(gòu),熒光與有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu),熒光強(qiáng)度與濃度的關(guān)系,熒光的淬滅,熒 光 淬 滅：熒光分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子相互作用引起熒光強(qiáng)度降低或消失的現(xiàn)象。 熒光淬滅劑：這些溶劑分子或其它溶質(zhì)分子稱為熒光淬滅劑（如鹵素離子、重金屬離子、氧分子、硝基/羰基/羧基化合物等）。,熒光能量共振轉(zhuǎn)移（FRET）,能量共振轉(zhuǎn)移（FRET） Fluorescence Resonance Energy Transfer,相

16、互作用的研究,熒光分光光度計(jì),光源,氙燈,激發(fā)單色器,樣品池,光電倍增管,數(shù)據(jù)處理 儀器控制,發(fā)射單色器,問(wèn)題：熒光分光光度計(jì)與紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)有何異同點(diǎn)？,紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì):,熒光(磷光)分光光度計(jì):,熒光分光光度計(jì),樣品池,1.樣品池的材料：與紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的吸收池一樣,2. 吸收池的形狀： 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的吸收池兩面透光 熒光分光光度計(jì)的樣品池四面透光,問(wèn)題：紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的吸收池與熒光分光光度計(jì)的樣品池有什么區(qū)別？,熒光分光光度計(jì),紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)量池(吸收池),熒光分光光度計(jì) 樣品池,I0,It,I0,It,IF,p,熒光分光光度計(jì),熒光光譜的應(yīng)用,芳

17、香族化合物存在共軛的不飽和體系，是有機(jī)化合物熒光測(cè)定的主要類型。,1. 有機(jī)化合物的鑒定,熒光光譜的應(yīng)用,2. 分子標(biāo)記與追蹤,在生物學(xué)研究中，科學(xué)家們利用能發(fā)光的熒光分子對(duì)生物體進(jìn)行標(biāo)記。將熒光分子通過(guò)化學(xué)方法“掛在”其他“不可見(jiàn)”的分子上，原來(lái)不可見(jiàn)的部分就變得可見(jiàn)了。生物學(xué)家利用這種標(biāo)記方法，把原本透明的細(xì)胞、細(xì)胞器或生物分子從黑暗的顯微鏡視場(chǎng)中“揪出來(lái)”。,量子點(diǎn) （無(wú)機(jī)納米粒子）,熒光染料 （有機(jī)小分子）,熒光蛋白 （蛋白質(zhì)）,熒光光譜的應(yīng)用,2.1熒光在核酸研究中的應(yīng)用電泳,Midori Green,Ethidiumbromide,熒光光譜的應(yīng)用,SYBR Green I,2.2熒

18、光在核酸研究中的應(yīng)用實(shí)時(shí)定量熒光PCR（RT-qPCR）,2.3熒光在核酸研究中的應(yīng)用分子信標(biāo),熒光光譜的應(yīng)用,Taq-Man,熒光光譜的應(yīng)用,2.4熒光在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用,幾種含苯基側(cè)鏈的氨基酸可以發(fā)出熒光，且受微環(huán)境變化的影響，因此可用于作為內(nèi)源熒光探針來(lái)研究蛋白質(zhì)構(gòu)象。,熒光光譜的應(yīng)用,2.5 ELISA中的“熒光”,熒光光譜的應(yīng)用,下村修等人于1962年在一種學(xué)名為Aequorea victoria的水母中發(fā)現(xiàn)能發(fā)光的蛋白綠色熒光蛋白（green fluorescent protein, GFP）。分子質(zhì)量為26kDa，由238個(gè)氨基酸構(gòu)成。,2008年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予了下村修以及另外兩位科學(xué)家（美國(guó)科學(xué)家馬丁沙爾菲和美籍華裔科學(xué)家錢永?。?，以表彰他們發(fā)現(xiàn)和發(fā)展了綠色熒光蛋白質(zhì)技術(shù)。,細(xì) 胞 標(biāo) 記,熒光光譜的應(yīng)用,活 體 標(biāo) 記,熒光光譜的應(yīng)用,1.傳統(tǒng)的熒光分子在發(fā)光的同時(shí)，會(huì)產(chǎn)生具有毒性的氧自由基，導(dǎo)致被觀察的細(xì)胞死亡，這叫做“光毒性”，因此，在綠色熒光蛋白發(fā)現(xiàn)以前，科學(xué)家們只能通過(guò)熒光標(biāo)記來(lái)研究死亡細(xì)胞靜態(tài)結(jié)構(gòu)，而綠色熒光蛋白的光毒性非常弱，非常適合用于標(biāo)記活細(xì)胞，在GFP出現(xiàn)之前這完全不可想象。 2.熒光蛋白與靶蛋白的連接可直接通過(guò)二者表達(dá)基因的融合，轉(zhuǎn)導(dǎo)至宿主細(xì)胞，在宿主細(xì)胞中翻譯表達(dá)出靶蛋白與熒光蛋白的復(fù)合體。,綠色熒光