流式細(xì)胞儀上機(jī)培訓(xùn)手冊(cè)

1、流式細(xì)胞儀上機(jī)操作培訓(xùn)手冊(cè)一、樣本處理以PBMC表面抗原的流式檢測(cè)步驟為例1) 取樣。取新鮮提取或凍存后復(fù)蘇的PBMC；2) 編號(hào)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，標(biāo)記好流式管，如每份PBMC設(shè)兩管：a) 1號(hào)管：相應(yīng)同型對(duì)照；b) 2號(hào)管：CD3,CD4,CD8,CD56四標(biāo)管；3) 加樣。用移液器取100ul細(xì)胞/管（約1106個(gè)細(xì)胞/管），分別加到已經(jīng)標(biāo)記好的流式管底部；4) 洗滌。加入1ml PBS/管，渦旋1600rpm/min，離心6min；5) 染色。棄上清，加入100 l PBS/管渦旋混勻細(xì)胞，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，向各流式管中加入相應(yīng)的熒光素標(biāo)記抗體，混勻，室溫避光孵育30min（操作盡量保持在避

2、光條件下進(jìn)行。）6) 洗滌。加入1ml PBS/管，渦旋1600rpm/min，離心6min；7) 重懸。棄上清，加入0.5ml PBS/管，混勻，上機(jī)檢測(cè)(可選擇BD FACSCanto II或BD Accuri C6)。（注：若不能及時(shí)上機(jī)，應(yīng)加入4%多聚甲醛固定，并于4避光保存。）8） 試驗(yàn)結(jié)果分析。 （注：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中如果進(jìn)行多色標(biāo)記，需要調(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償）。參考值：CD3+60.8-75.4%CD4+29.4-45.8%CD8+18.2-32.8%NK（CD3-CD56+）9.5-23.5%二、上機(jī)檢測(cè)BD FACSCanto II簡(jiǎn)要操作流程啟動(dòng)流式細(xì)胞儀1 打開(kāi)流式細(xì)胞儀電源2 啟動(dòng)計(jì)

3、算機(jī)，打開(kāi)軟件登錄3 確保軟件連接到流式細(xì)胞儀必要時(shí)，點(diǎn)擊Cytometer connect檢查液體水平1 啟動(dòng)流式細(xì)胞儀后，檢查液體水平 低液面水平或者廢液桶滿(mǎn)都用紅色指示。2 如果液流車(chē)未自動(dòng)開(kāi)啟，選擇Cytometer Fluidics Startup。3 當(dāng)液流啟動(dòng)完成后，點(diǎn)擊OK關(guān)閉對(duì)話(huà)框。檢查氣泡1 在檢查完液體水平后，開(kāi)啟流動(dòng)室門(mén)，檢查流動(dòng)室中是否有氣泡。2 如果沒(méi)有看到氣泡，進(jìn)行第5步。如果看到氣泡，點(diǎn)擊Cytometer Cleaning Modes De-gas Flow Cell.3 當(dāng)完成信息出現(xiàn)后，點(diǎn)擊OK。4 如果還可以看到氣泡，重復(fù)上述操作。注意：如果打開(kāi)流動(dòng)室細(xì)

4、胞進(jìn)口門(mén)時(shí)出現(xiàn)錯(cuò)誤信息，通過(guò)關(guān)閉進(jìn)口門(mén)，并等待30秒關(guān)閉該信息。5 當(dāng)您完成上述操作后，在往下進(jìn)行之前請(qǐng)先檢查激光預(yù)熱是否已經(jīng)完成。創(chuàng)建實(shí)驗(yàn)1 按照需要，在工作區(qū)工具欄中點(diǎn)擊相應(yīng)的按鈕來(lái)顯示瀏覽器、細(xì)胞儀、檢測(cè)器、工作表、獲取控制板和雙指數(shù)編輯器窗口。2 創(chuàng)建文件夾： A 在瀏覽器中選擇數(shù)據(jù)庫(kù)圖標(biāo)，并點(diǎn)擊瀏覽器工具欄上的New Folder。 B 對(duì)該文件夾命名。3 選擇該文件夾，點(diǎn)擊New Experriment來(lái)創(chuàng)建一個(gè)新實(shí)驗(yàn)。4 對(duì)該實(shí)驗(yàn)進(jìn)行重命名。5 選擇實(shí)驗(yàn)級(jí)別的細(xì)胞儀設(shè)置，然后點(diǎn)擊Inspector(檢測(cè)器)中的Parameters(參數(shù))選項(xiàng)卡。6 按照需要變更，添加或者刪除參數(shù)

5、。運(yùn)行樣本并記錄數(shù)據(jù)1 將樣品管安裝到流式細(xì)胞儀中并點(diǎn)擊Aquire Data(獲取數(shù)據(jù))。 A 把抽吸臂向左側(cè)推。B 把流式管放置到SIT上，確保試管豎直，并用力向上推試管直到試管完個(gè)停止并完個(gè)就位。C 把抽吸臂放置到試管下的中心位置。抽吸臂上有3個(gè)傳感器引腳。試管底部應(yīng)定位在這些引腳的中心位置內(nèi)。2 調(diào)節(jié)FSC和SSC電壓以正確顯示細(xì)胞的散射光特征。3 必要時(shí)，點(diǎn)擊閾值圖標(biāo)并對(duì)FSC閾值進(jìn)行調(diào)節(jié)。4 調(diào)節(jié)P1門(mén)僅圍繞目的細(xì)胞群體。5 調(diào)節(jié)好后，點(diǎn)擊Record Data(記錄數(shù)據(jù))以記錄數(shù)據(jù)。6 獲取停止，取出試管。建立全局工作表1 如果用戶(hù)參數(shù)中啟用了Default global wor

6、ksheet(默認(rèn)個(gè)局工作表)(默認(rèn)選項(xiàng))，則全局工作表已經(jīng)存在。展開(kāi)全局工作表文件夾來(lái)定位和重命名工作表。（注：如果Default global worksheet被禁用，則通過(guò)點(diǎn)擊瀏覽器工具欄中的New Global Worksheet(新個(gè)局工作表)按鈕創(chuàng)建個(gè)局工作表。）2 使用設(shè)計(jì)對(duì)話(huà)框定義參數(shù)標(biāo)記并指定各個(gè)試管要記錄的細(xì)胞顆粒數(shù)。標(biāo)記會(huì)出現(xiàn)在點(diǎn)圖軸上和所有的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖中。 A 選擇Experiment(實(shí)驗(yàn))Experiment Layout(實(shí)驗(yàn)布局)。 B 在Labels(標(biāo)簽)選項(xiàng)卡中，為試管輸入適當(dāng)?shù)臉?biāo)簽。例如，在FITC域中輸入CD3。使用Tab鍵移動(dòng)到下一個(gè)域。3 在該全

7、局工作表中，創(chuàng)建用預(yù)覽數(shù)據(jù)的點(diǎn)圖。例如:創(chuàng)建PerCP-Cy5.5對(duì)SSC,FITC對(duì)APC, FITC對(duì)PE, FITC對(duì)PE-Cy7和F ITC對(duì)APC-Cy7點(diǎn)圖。設(shè)門(mén)通過(guò)設(shè)門(mén)的方法可以定義細(xì)胞亞群的區(qū)域。如：PBMC樣本是混合細(xì)胞群，如果想單獨(dú)分析淋巴球細(xì)胞，可根據(jù)FSC或細(xì)胞大小，在 FSC，SSC的散點(diǎn)圖中設(shè)門(mén)，其數(shù)據(jù)結(jié)果只反映淋巴細(xì)胞亞群的熒光特性。關(guān)機(jī)1選擇Cytometer(細(xì)胞儀)Fluidics Shutdown(液流關(guān)閉)，并遵循所有的提示。2關(guān)閉細(xì)胞儀電源。3退出BD FACSDiva軟件。C6簡(jiǎn)要操作流程開(kāi)機(jī)1. 打開(kāi)電腦，上樣處放置一管雙蒸水2. 打開(kāi)C6儀器，其

8、自動(dòng)執(zhí)行“startup”，時(shí)間約5min，期間禁止開(kāi)蓋3. 當(dāng)軟件顯示儀器狀態(tài)為“Cytometer Connected and ready”并亮綠燈時(shí)，則可以上樣4. （推薦用質(zhì)控微球上機(jī)，F(xiàn)L1-H和FL2-H直方圖中必須有八個(gè)峰，F(xiàn)L3-H中必須有6-8個(gè)峰，即儀器分辨率CV值滿(mǎn)足標(biāo)準(zhǔn)）采集樣品1. 樣品震蕩混勻后置于上樣二檔處2. 設(shè)置流速，采樣數(shù)目或時(shí)間或體積3. 點(diǎn)擊“Dot Plot”或“Histogram”或“Density Plot”，選擇需要的圖形4. 點(diǎn)擊坐標(biāo)軸參數(shù)，從下拉菜單中選擇需要的參數(shù)（如：“FL1-A”“FSC-A”）5. 點(diǎn)擊“Plot Spec”，選擇“l(fā)

9、inear”或者“l(fā)og”，設(shè)置坐標(biāo)軸顯示范圍6. 右擊坐標(biāo)軸參數(shù)，選擇“Rename Parameters”，進(jìn)行坐標(biāo)軸重命名7. 選擇“Display”中的“Events Display Settings”，選擇顯示的細(xì)胞數(shù)8. 選擇樣品位置，點(diǎn)擊“run”，進(jìn)行采樣9. 取下樣品10. 取新的流式細(xì)胞管置于上樣針處，點(diǎn)擊“backflush”，清洗上樣針11. 樣品命名12. 點(diǎn)擊“Zoom In”，放大指定區(qū)域，設(shè)置閾值。點(diǎn)擊“Zoom Out”，返回放大設(shè)門(mén)1. 在圖像下方點(diǎn)擊設(shè)門(mén)工具，圈定指定區(qū)域，設(shè)置為門(mén)2. 點(diǎn)擊相應(yīng)圖像上方的“Gate”，選擇該圖像需要應(yīng)用的門(mén)設(shè)置補(bǔ)償若樣本是雙熒光或三熒光檢測(cè)，則實(shí)際圖像顯示中會(huì)用到熒光補(bǔ)償1. 點(diǎn)擊“Set Color Compensation”2. 選擇需要補(bǔ)償?shù)臒晒鈪?shù)，輸入補(bǔ)償值，點(diǎn)擊“Save & Close”分析統(tǒng)計(jì)點(diǎn)擊“Statistic”可選擇預(yù)覽選擇的樣品圖形，所有的Plot列表。所有的Plots，Gates以及統(tǒng)計(jì)學(xué)的列表，從中選擇需要顯示的信息關(guān)機(jī)清洗1. 放置一管去離子水，運(yùn)行2min，清洗時(shí)10 Events/sec 才算