免疫實(shí)驗(yàn)技術(shù).ppt

1、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù),浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院,利用免疫學(xué)原理來(lái)檢測(cè)抗原、多種免疫分子(抗體、補(bǔ)體、細(xì)胞因子和粘附分子等)及免疫細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)過(guò)程。 有助于疾病的輔助診斷、治療及預(yù)后判斷 。,一、 凝集反應(yīng) 顆粒性抗原（細(xì)胞、細(xì)菌等）或吸附于免疫無(wú)關(guān)載體上的可溶性抗原與相應(yīng)抗體，在適量電解質(zhì)的存在下，形成肉眼可見(jiàn)的凝集團(tuán)塊。 1、直接凝集反應(yīng) （1）玻片凝集試驗(yàn) ABO血型鑒定 （2）試管凝集試驗(yàn) 肥達(dá)試驗(yàn) 效價(jià)（滴度）：以出現(xiàn)明顯抗原抗體反應(yīng)現(xiàn)象的最高稀釋度作為待檢抗原（或抗體）的含量。,凝集反應(yīng)（agglutination),顆粒型抗原 細(xì)菌、細(xì)胞,抗體 （凝集素）,電解質(zhì) （生理鹽水）,3750數(shù)小時(shí),凝集

2、反應(yīng)（凝集成團(tuán)）,1. 直接凝集試驗(yàn),玻片法,試管法,含有已知抗體 的診斷血清,待檢菌液,生理鹽水,特點(diǎn),簡(jiǎn)便、快速 不能定量,UUUU,待檢血清,鹽水,簡(jiǎn)便、快速 能定量,肥達(dá)氏試驗(yàn)（widal test),傷寒、副傷寒,已知抗原,2、間接凝集反應(yīng) 指可溶性抗原(或抗體)吸附在乳膠顆?；蚣t細(xì)胞等載體表面與相應(yīng)抗體(或抗原)結(jié)合反應(yīng)，在適宜的條件下，出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。 正向間接凝集反應(yīng) 用可溶性抗原包被載體以檢測(cè)抗體。 反向間接凝集反應(yīng) 用抗體包被載體以檢測(cè)抗原。,二、沉淀反應(yīng) 可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合，當(dāng)兩者比例合適，并有適量電解質(zhì)存在時(shí)，形成肉眼可見(jiàn)的沉淀物或沉淀線。,沉淀試驗(yàn)（precipi

3、tation test）,可溶性抗原 細(xì)胞裂解液,抗體 （沉淀素）,電解質(zhì) （生理鹽水）,3750數(shù)小時(shí),沉淀反應(yīng)（清澄液中出現(xiàn)混濁沉淀）,沉淀反應(yīng)分類 （1）瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) a.單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) b.雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) （2）免疫電泳試驗(yàn) 對(duì)流免疫電泳：原理：在陰極孔內(nèi)加抗原，陽(yáng)極孔內(nèi)加抗體。通電后，抗原帶負(fù)電荷較多，分子較小，向陽(yáng)極泳動(dòng)；抗體分子帶負(fù)電荷較少，加上分子量大，在瓊脂的電滲作用下向陰極泳動(dòng)。 （3）環(huán)狀沉淀試驗(yàn),（1）單向擴(kuò)散試驗(yàn) （Single redial diffusion test）,（2）雙向擴(kuò)散試驗(yàn) （Double diffusion test）,（3）對(duì)流免疫電泳,作

4、用及特點(diǎn)： 抗體球蛋白移向陰極，抗原分子移向陽(yáng)極，當(dāng)兩者在適當(dāng)比例處相遇，即形成灰白色沉淀線。 檢查乙型肝炎抗原及甲胎蛋白，敏感度比雙向擴(kuò)散法高約10倍，只需12小時(shí)即可獲得檢驗(yàn)結(jié)果。 不能定量測(cè)定。,Ag,Ab,_,+,三、 免疫標(biāo)記技術(shù) 原理： 利用酶、熒光素、膠體金、發(fā)光物質(zhì)以及放射性核素等標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記抗原或抗體，再與標(biāo)本中的抗體或抗原反應(yīng)，最后測(cè)定復(fù)合物中的標(biāo)記物。 優(yōu)點(diǎn)：特異、敏感、快速，可作定性、定量或定位測(cè)定。,依據(jù)檢測(cè)物分兩類： 1.免疫組化技術(shù)(immunohistochemical technique)，用于組織/細(xì)胞中抗原或抗體的定位； 2.免疫測(cè)定(immunoassa

5、y)，用于液體標(biāo)本中抗原或抗體的檢測(cè)。 依據(jù)標(biāo)記物的不同，可分為： 酶免疫技術(shù)、熒光免疫技術(shù)、金免疫技術(shù)、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)和放射免疫技術(shù)。 1、酶免疫技術(shù) 酶免疫技術(shù)是以酶標(biāo)記的抗體或抗原進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)。,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA) 屬固相酶免疫測(cè)定 ELISA原理： 把待測(cè)標(biāo)本(含有未知抗體或抗原)和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的順序與固相抗原或抗體起反應(yīng)，再洗滌固相載體，隨后加入酶的底物，底物受酶催化轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩a(chǎn)物。根據(jù)顏色的深淺對(duì)待測(cè)物質(zhì)定性或定量。,三種試劑： 固相抗原或抗體 即把抗原或抗體用合適的方法連接到固相載體表面

6、，同時(shí)保留它們的免疫活性； 酶標(biāo)抗原或抗體 即把某些酶用合適的方法連接到抗原或抗體表面，同時(shí)保留它們的免疫活性以及酶的催化活性。常用的酶是辣根過(guò)氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(AP)； 酶作用的底物 常用的底物是鄰苯二胺,ELISA的類型： (1)雙抗體夾心法 測(cè)抗原 1）已知抗體包被 2）洗板 3）加待檢抗原標(biāo)本 4）洗板 5）加酶標(biāo)記抗體 6）洗板 7）加底物顯色，測(cè)定,（2）間接法 測(cè)抗體 1）己知抗原包被 2）洗板 3）加待檢病人血清 4）洗板 5）加酶標(biāo)記抗人IgG 6）洗板 7）加底物顯色，測(cè)定 （3）競(jìng)爭(zhēng)法 測(cè)抗原或抗體 測(cè)定抗原：在待測(cè)管中加入受檢抗原和酶標(biāo)抗原，使它們同固相抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）,間接法,Ag,待檢血清,酶標(biāo)抗抗體,檢測(cè) 抗體,雙抗體法,Ag,檢測(cè) 抗原,待檢抗原,抗原競(jìng) 爭(zhēng)法,Ag,待檢抗原,酶標(biāo)抗原,Ag,檢測(cè) 抗原,2、膠體金免疫技術(shù) 以膠體金為標(biāo)記物的抗原抗體反應(yīng)。常與膜載體技術(shù)結(jié)合，包括斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)和斑點(diǎn)金免疫層析試驗(yàn)等。 斑點(diǎn)金免疫層析試驗(yàn)(dot gold immunochrom