核酸化學(xué)課件.ppt

1、第二章 核 酸 (Nucleic Acid),主要介紹堿基、核苷、核苷酸和核酸的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能，核酸的分離、提純、鑒定等。,一 核酸的概念,核酸英文名nucleic acid（NA）,1868年瑞士F. Miescher（米歇爾）發(fā)現(xiàn)了核酸。,第一節(jié) 核酸的概念和及生物學(xué)意義,核酸是由幾十個甚至幾千萬個核苷酸聚合而成的具有一定空間結(jié)構(gòu)的大分子化合物。,二 核酸的分類、分布和生物學(xué)功能,核酸分為兩大類. 脫氧核糖核酸（DNA） Deoxyribonucleic Acid 核糖核酸（RNA） Ribonucleic Acid。,DNA分子含有生物物種的所有遺傳信息，分子量一般都很大。 DNA為雙

2、鏈分子，其中大多數(shù)是鏈狀結(jié)構(gòu)大分子，也有少部分呈環(huán)狀結(jié)構(gòu)。,脫氧核糖核酸（DNA）,DNA,雙鏈線狀,雙鏈環(huán)狀,單鏈線狀：動物病毒MVM,單鏈環(huán)狀：噬菌體X174,真核細(xì)胞染色體DNA,噬菌體T2，T5，T7，P22,E-Coli染色體DNA,線粒體DNA,葉綠體DNA,多瘤病毒DNA，病毒SV40DNA,噬菌體和X174的復(fù)制型,DNA的生物功能,DNA是主要的遺傳物質(zhì),基因：是指在染色體上占有一定位置的遺傳單位。 基因有三個基本屬性： 可通過復(fù)制，將遺傳信息由親代傳遞給子代； 經(jīng)轉(zhuǎn)錄對表型有一定的效應(yīng)； 可突變形成各種等位基因。 DNA具有基因的所有屬性，基因也就是DNA的一個片段。,19

3、44年Avery細(xì)菌轉(zhuǎn)化實驗,轉(zhuǎn)化作用：,轉(zhuǎn)化作用的物質(zhì)稱轉(zhuǎn)化因子,從一種細(xì)菌中得到DNA通過一定途徑進(jìn)入另一種細(xì)菌，從而引起后者遺傳特性的改變。, 噬菌體感染實驗,1952年美國Hershey 噬菌體感染實驗,DNA與遺傳性疾病、癌變的關(guān)系,（1）鐮刀狀紅細(xì)胞貧血病的DNA點突變,（2）白化病的基因缺失,（3）癌變,核糖核酸（RNA）,RNA主要是負(fù)責(zé)DNA遺傳信息的翻譯和表達(dá)，分子量要比DNA小得多。RNA為單鏈分子。,RNA的類別,根據(jù)RNA的功能，可以分為mRNA、tRNA和rRNA三種。,其它類別的RNA,（1）病毒RNA（Viral RNA, rRNA）,（2）核內(nèi)RNA（nucl

4、ear RNA, nRNA）, 不均一核RNA（heterogeneous nuclear RNA,HnRNA）, 小分子核RNA（small nuclear RNA, sn RNA）, 小分子核仁RNA（small nucleolar RNA, sno RNA）, 染色體RNA（chromosomal RNA, ch RNA）,（3）線粒體RNA（mitochondrial RNA, mit RNA）,（4）葉綠體RNA（chloroplast RNA, chlRNA或ctRNA）,mRNA (信使RNA),約占總RNA的5%。 不同細(xì)胞的mRNA的鏈長和分子量差異很大。 它的功能是將DNA

5、的遺傳信息傳遞到蛋白質(zhì)合成基地 核糖核蛋白體。,Messenger RNA,tRNA (轉(zhuǎn)移RNA),約占總RNA的10-15%。 它在蛋白質(zhì)生物合成中起翻譯氨基酸信息，并將相應(yīng)的氨基酸轉(zhuǎn)運到核糖核蛋白體的作用。 已知每一個氨基酸至少有一個相應(yīng)的tRNA。 RNA分子的大小很相似，鏈長一般在73-78個核苷酸之間。,Transfer RNA,rRNA (核糖體RNA),約占全部RNA的80%， 是核糖核蛋白體的主要組成部分。 rRNA 的功能與蛋白質(zhì)生物合成相關(guān)。,Ribosome RNA,原核生物核糖體,70S,50S,30S,5S rRNA， 23S rRNA,34種蛋白質(zhì),16S rRN

6、A,21種蛋白質(zhì),真核生物核糖體,80S,60S,40S,5SrRNA，5.8SrRNA，28SrRNA,49種蛋白質(zhì),18SrRNA,33種蛋白質(zhì),RNA的生物功能,1RNA與蛋白質(zhì)的生物合成,（1）mRNA與遺傳密碼,（2）tRNA的作用,接受氨基酸、攜帶氨基酸，把氨基酸轉(zhuǎn)運到核糖體上，然后按照mRNA上的密碼順序裝配成多肽或蛋白質(zhì)。,（3）rRNA的作用,具有核酶活性，能夠催化肽鍵形成，起裝配和催化作用,第二節(jié) 核酸的組成,一 堿基（base）：又稱含氮堿,（1）嘧啶堿（pyrimidine, Py）,（2）嘌呤堿（purine, Pu）,其它嘌呤（核酸的代謝產(chǎn)物）：,黃嘌呤、次黃嘌呤、

7、尿酸等,（3）修飾堿基（modified base）： 也稱稀有堿基（minor base）,（一）核苷（nucleoside）,1核苷的結(jié)構(gòu),核苷：含N苷，-苷,二、核苷、核苷酸,核苷中戊糖與堿基的連接方式：,腺嘌呤核苷 （adenosine）,胞嘧啶脫氧核苷 （deoxycytidne）,核苷,核糖核苷（核苷）：A、G、C、U,脫氧核糖核苷（脫氧核苷）：dA、dG、dC、dT,命名，簡寫符號,天然核苷：一般為反式構(gòu)象,2修飾核苷（modified nucleoside）： 也稱稀有核苷（minor nucleoside）,修飾核苷包括三種情況:,（1）由修飾堿基和糖組成的核苷,（2）由非修

8、飾堿基和2-O-甲基核糖組成的核苷,（3）由堿基與糖連接方式特殊的核苷,（1）,（2）,（3）,(),修飾核苷的簡寫符號,少數(shù)修飾核苷用單字符號如D、I；但大多數(shù)修飾核苷是將堿基取代基、取代位置和取代數(shù)目寫在核苷單字符號的左邊，用小寫英文字母代表取代基。,取代基用下列小寫英文字母表示 :,注意：,例: 2-O-甲基腺苷 Am,含修飾核糖的核苷即2-O-甲基核苷的表示方法，在核苷符號的右下方注上一個小寫m。,（二）核苷酸（nucleotide, Nt）,1核苷酸的結(jié)構(gòu),（1）（核糖）核苷酸（ribonucleotide）：,2，3，5一核糖核苷酸,(2-AMP),(3-AMP),(5-AMP),

9、3，5一脫氧核糖核苷酸,Deoxyadenosine 3- monphosphate (3- dAMP),Deoxyadenosine 5- monphosphate (5- dAMP),（2）脫氧（核糖）核苷酸（deoxyribonucleotide）：,（三）核苷酸的衍生物,ATP是生物體內(nèi)分布最廣和最重要的一種核苷酸衍生物。它的結(jié)構(gòu)如下：,（1） ATP (腺嘌呤核糖核苷三磷酸),ATP的性質(zhì),ATP 分子的最顯著特點是含有兩個高能磷酸鍵。ATP水解時, 可以釋放出大量自由能。 ATP 是生物體內(nèi)最重要的能量轉(zhuǎn)換中間體。ATP 水解釋放出來的能量用于推動生物體內(nèi)各種需能的生化反應(yīng)。,cA

10、MP 和 cGMP,cAMP(3,5- 環(huán)腺嘌呤核苷一磷酸)和 cGMP( 3,5-環(huán)鳥嘌呤核苷一磷酸)的主要功能是作為細(xì)胞之間傳遞信息的信使。,胞內(nèi),ATP cAMP + PPi,磷酸二酯酶,5-AMP,腺苷酸環(huán)化酶 （AC）,（一）DNA的一級結(jié)構(gòu)Primary structure即DNA的共價結(jié)構(gòu),1DNA分子中核苷酸的連接方式,第三節(jié) 核酸的分子結(jié)構(gòu),包括DNA的結(jié)構(gòu)、RNA的結(jié)構(gòu),。,RNA,簡寫方法：線條式、文字式,在討論有關(guān)核酸問題時，一般只關(guān)心其中堿基的種類和順序，所以上式可以進(jìn)一步簡化為： 5PAPCPGPCPTPGPTPA 3 或5 ACGCTGTA 3,在DNA一級結(jié)構(gòu)中

11、，有一種回文結(jié)構(gòu)的特殊序列，所謂回文結(jié)構(gòu)即DNA互補鏈上一段反向重復(fù)順序，正讀和反讀意義相同，經(jīng)反折可形成“十字形”結(jié)構(gòu)，在轉(zhuǎn)錄成RNA后可形成“發(fā)夾”樣結(jié)構(gòu)，有調(diào)控意義。 GCTA GTTCA CTC TGAAC AATT CGAT CAAGT GAG ACTTG TTAA ,1提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的根據(jù),（2）x-光衍射分析,（二）DNA的二級結(jié)構(gòu),（1）已知核酸化學(xué)結(jié)構(gòu)和核苷酸鍵長鍵角的數(shù)據(jù),（3）DNA堿基組成的定量分析,20世紀(jì)40年代chargaff規(guī)則, DNA堿基組成有種的特異性，但沒有組織、器官特異性。, A=T；G=C；A+G=T+C ；A+C=T+G ；,2DNA雙螺

12、旋結(jié)構(gòu)模型（double-helical structure）,1953年Watson和Crick提出了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)。,DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)要點：,1兩條反向平行的多核苷酸鏈形成右手螺旋。一條鏈為5 3，另一條為3 5。（某些病毒的DNA是單鏈分子ssDNA） 2堿基在雙螺旋內(nèi)側(cè)，A與T，G與C配對，A與T形成兩個氫鍵，G與C形成三個氫鍵。糖基-磷酸基骨架在外側(cè)。表面有一條大溝和一小溝。 3螺距為3.4 nm，含10個堿基對（bp），相鄰堿基對平面間的距離為0.34 nm。螺旋直徑為2 nm。 氫鍵維持雙螺旋的橫向穩(wěn)定。堿基對平面幾乎垂直螺旋軸，堿基對平面間的疏水堆積力維持螺旋的縱向穩(wěn)定。,4

13、堿基在一條鏈上的排列順序不受限制。遺傳信息由堿基序所攜帶。 5DNA構(gòu)象有多態(tài)性。,穩(wěn)定DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵,（1）互補堿基對之間的氫鍵,（2）堿基堆積力（base-stacking forces）：堿基有規(guī)律的堆積， 使堿基之間發(fā)生締合，形成了堿基堆積力，由堿基的電子之間 的堿基相互作用而產(chǎn)生的。,（3）磷酸基上的負(fù)電荷與介質(zhì)中的陽離子之間形成的離子鍵 生理pH條件下DNA帶有大量的負(fù)電荷，吸引著各種陽離子，組蛋白、 Na+、K+ 、Mg2+ 等，形成了離子鍵，消除了自身因帶負(fù)電荷而產(chǎn)生 的斥力，增加了DNA的穩(wěn)定性。,3DNA雙螺旋的種類,Watson Crick DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)（B

14、型DNA）,當(dāng)DNA鈉鹽纖維相對濕度和鹽的種類改變時， DNA的構(gòu)象發(fā)生改變。,不同DNA纖維的空間結(jié)構(gòu),A-DNA：,與B-DNA相同處：,與B-DNA不同點 :,（1）螺體寬而短，直徑2.55nm；11個核苷酸一圈，螺距2.46nm。,（2）堿基的傾角大一些：傾角19。,A-DNA：RNA分子中的雙螺旋區(qū)；DNA-RNA雜交分子。,A-DNA和B-DNA之間可以相互轉(zhuǎn)換，推測在轉(zhuǎn)錄時，DNA分子發(fā)生BA的轉(zhuǎn)變。,反向的兩條多核苷酸鏈，右手螺旋。,4DNA雙螺旋的研究進(jìn)展,（1）Z-DNA,1979年美國ARich等人發(fā)現(xiàn)了左旋DNA（左手DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)）,Z-DNA特點： 兩條多核苷酸繞

15、成一個左手螺旋； 糖磷酸骨架鏈的走向呈“Z”字形，因此被稱為Z-DNA； 分子外表只有一道溝槽（大溝消失,小溝加深）； 堿基對在分子軸外側(cè)，并構(gòu)成分子的凸面； DNA雙螺旋體比較細(xì)長。,概括：,A型螺旋比較粗短，堿基傾角大一些，大溝深度明顯超過小溝； B型比較適中； Z型細(xì)長，大溝平坦，核苷酸構(gòu)象順反相間，使磷酸和糖骨架呈Z字形。,DNA二級結(jié)構(gòu)還存在三股螺旋DNA，三股螺旋DNA中通常是一條同型寡核苷酸與寡嘧啶核苷酸-寡嘌呤核苷酸雙螺旋的大溝結(jié)合，第三股的堿基可與Watson-Crick堿基對中的嘌呤堿形成Hoogsteen配對。 三股螺旋中的第三股可以來自分子間，也可以來自分子內(nèi)。 三股螺

16、旋DNA存在于基因調(diào)控區(qū)和其他重要區(qū)域，因此具有重要生理意義。,（2）三螺旋DNA,（2）三螺旋DNA,A（T）*A T;G（C）*G C H-DNA,（三）DNA的三級結(jié)構(gòu),DNA三級結(jié)構(gòu)是指DNA鏈進(jìn)一步扭曲盤旋形成超螺旋結(jié)構(gòu)。 生物體內(nèi)有些DNA是以雙鏈環(huán)狀DNA形式存在，如有些病毒DNA，某些噬菌體DNA，細(xì)菌染色體與細(xì)菌中質(zhì)粒DNA，真核細(xì)胞中的線粒體DNA、葉綠體DNA都是環(huán)狀的。 環(huán)狀DNA分子可以是共價閉合環(huán)，即環(huán)上沒有缺口，也可以是缺口環(huán)，環(huán)上有一個或多個缺口。,在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，共價閉合環(huán)DNA（covalentlyclose circular DNA）可以進(jìn)一步扭

17、曲形成超螺旋形（super helical form）。根據(jù)螺旋的方向可分為正超螺旋和負(fù)超螺旋。正超螺旋使雙螺旋結(jié)構(gòu)更緊密，雙螺旋圈數(shù)增加，而負(fù)超螺旋可以減少雙螺旋的圈數(shù)。幾乎所有天然DNA中都存在負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)。,一段雙螺旋圈數(shù)為10的B-DNA連接成環(huán)形時，不發(fā)生進(jìn)一步扭曲，稱松弛環(huán)形DNA（雙螺旋的圈數(shù)=鏈繞數(shù)，即T=L，超螺旋數(shù)W=0；L=T+W），但將這一線形DNA的螺旋先擰松一圈再連接成環(huán)時，解鏈環(huán)形DNA存在的扭曲張力，可導(dǎo)致雙鏈環(huán)形成負(fù)超螺旋（T10，L=9，W = -1）。 L為連環(huán)數(shù)；T為扭轉(zhuǎn)數(shù)；W為超螺旋數(shù)。 L=T+W 比連環(huán)差： (L-L0)/L0 在生物體內(nèi)，絕大多數(shù)

18、超螺旋DNA以負(fù)超螺旋的形式存在，也就是說，一旦超螺旋解開，則會形成解鏈環(huán)形DNA，有利于DNA復(fù)制或轉(zhuǎn)錄。 螺旋具有相同的結(jié)構(gòu)，但L值不同的分子稱為拓?fù)洚悩?gòu)體。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶切斷一條鏈或兩條鏈，拓?fù)洚悩?gòu)體可以相互轉(zhuǎn)變。L值必定是整數(shù)。,（四）真核生物染色體,真核細(xì)胞DNA是線形分子，與組蛋白結(jié)合，其兩端固定也形成超螺旋結(jié)構(gòu)。DNA被緊密地包裝成染色體來自三個水平的折疊：核小體、30nm纖絲和放射環(huán)。 核小體是染色體的基本結(jié)構(gòu)單位，是DNA包裝的第一步，它由DNA結(jié)合到組蛋白上形成復(fù)合物，在電鏡下顯示為成串的“念珠”狀。組蛋白是富含精氨酸和賴氨酸的堿性蛋白質(zhì)，其氨基酸序列在進(jìn)化中是高度保守的

19、。組蛋白有5種，H2A、H2B、H3和H4各兩分子組成的八聚體是核小體核心顆粒，DNA纏繞其上，相鄰核小體間的DNA稱為連接DNA且結(jié)合H1。壓縮比約為7 。 30nm纖絲是第二級壓縮，每圈含6個核小體，壓縮比是6。 30nm螺旋管再纏繞成超螺旋圓筒，壓縮比是40。 再進(jìn)一步形成染色單體，總壓縮近一萬倍。典型人體細(xì)胞的DNA理論長度應(yīng)是180 cm，被包裝在46個5m的染色體中。,RNA通常以單鏈形式存在，比DNA分子小得多，由數(shù)十個至數(shù)千個核苷酸組成。RNA鏈可以回折且通過A與U，G與C配對形成局部的雙螺旋，不能配對的堿基則形成環(huán)狀突起，這種短的雙螺旋區(qū)和環(huán)稱為發(fā)夾結(jié)構(gòu)。 RNA的C2位羥基

20、是游離的，是一個易發(fā)生不良反應(yīng)的位置，它使RNA的化學(xué)性質(zhì)不如DNA穩(wěn)定，能較DNA產(chǎn)生更多的修飾組分。RNA的種類、大小、結(jié)構(gòu)都比DNA多樣化，按照功能的不同和結(jié)構(gòu)的特點，RNA主要分為tRNA、rRNA和mRNA三類。 此外，細(xì)胞的不同部位還存在著另一些小分子RNA，如核內(nèi)小RNA（snRNA）、核仁小RNA（snoRNA）、胞質(zhì)小RNA（scRNA）等，分別參與mRNA的前體（hnRNA）和rRNA的轉(zhuǎn)運和加工過程。,RNA的結(jié)構(gòu),幾類RNA的結(jié)構(gòu),（1） tRNA的結(jié)構(gòu)：分子量最小的RNA，約占總RNA的15%。主要功能是在蛋白質(zhì)生物合成過程中，起著轉(zhuǎn)運氨基酸的作用。,1965年Hol

21、ley等測定了酵母丙氨酸t(yī)RNA的一級結(jié)構(gòu)，并提出二級結(jié)構(gòu)模型。,1.一級結(jié)構(gòu)特點：核苷酸殘基數(shù)在7395；含有較多的稀有堿基（如mG、DHU等）；5-末端多為pG，3- 末端都是-CCA。,2tRNA的二級結(jié)構(gòu)為“三葉草”形，包括4個螺旋區(qū)、3個環(huán)及一個附加叉。各部分的結(jié)構(gòu)都和它的功能有關(guān)。5端17位與近3端6772位形成的雙螺旋區(qū)稱氨基酸臂，似“葉柄”，3端有共同的-CCA-OH結(jié)構(gòu)，用于連接該RNA轉(zhuǎn)運的氨基酸。3個環(huán)是二氫尿嘧啶環(huán)（D環(huán)）、反密碼子環(huán)、TC環(huán)。,319731975年S.H.Kim的X射線衍射分析表明，tRNA的三級結(jié)構(gòu)呈倒L字母形，反密碼環(huán)和氨基酸臂分別位于倒L的兩端,

22、tRNA的二級結(jié)構(gòu),（1）aa接受臂（amino acid arm）,（2）二氫尿嘧啶環(huán) （dihydrouridine loop, DHU loop）,（3）反密碼環(huán)（anticodon loop）,（4）額外環(huán)（extra loop）,（5）TC環(huán)（TC loop）,1980年牛心線粒體tRNAser只有63個核苷酸，沉降常數(shù)3S，缺少D環(huán)和D臂，呈二葉草型。,近年來發(fā)現(xiàn)2種線蟲線粒體tRNA也不是標(biāo)準(zhǔn)的三葉草結(jié)構(gòu)。,1約占細(xì)胞總RNA的80%。主要功能是與多種蛋白質(zhì)組成核糖體，是蛋白質(zhì)合成的場所。 2核糖體在結(jié)構(gòu)上可分離為大小兩個亞基。原核細(xì)胞的rRNA有3種，23S與5S rRNA在大

23、亞基，16S在小亞基。真核細(xì)胞有4種rRNA，其中大亞基含28S、5.8S、5S，小亞基只有18S。 3. 各種rRNA的一級結(jié)構(gòu)中的核苷酸殘基數(shù)及其順序都不相同，且有特定的二級結(jié)構(gòu)。,rRNA的結(jié)構(gòu),原核生物的mRNA特點： 原核生物以操縱子作為轉(zhuǎn)錄單位，產(chǎn)生多順反子mRNA，即一條mRNA鏈上有多個編碼區(qū)，5和3 端各有一段非翻譯區(qū)（UTR），無修飾堿基。,（3）mRNA的一級結(jié)構(gòu),真核生物mRNA的一級結(jié)構(gòu)可用下式表示 :,5-cap：m7G(5)pppNmp,5-cap,cap0: m7G(5)pppNp,cap1: m7G(5)pppNmpNp,cap2: m7G(5)pppNmpN

24、mpNp,5-cap的功能,(1) 防止mRNA被核酸酶降解。,(2) 為mRNA翻譯活性所必需。,(3) 與蛋白質(zhì)合成的正確起始有關(guān)。,3-polyA : polyA的殘基數(shù)20200個，或更多。,polyA的功能,(1) 保護(hù)mRNA，免受核酸外切酶的作用。,(2) 與翻譯有關(guān)，沒有polyA翻譯活性降低。,(3) 與mRNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)有關(guān)。,DNA和RNA中的糖苷鍵與磷酸酯鍵都能用化學(xué)法和酶法水解。 并且堿基和核糖之間的糖苷鍵更易被水解，其中嘌呤堿的糖苷鍵比嘧啶堿的糖苷鍵對酸更不穩(wěn)定。 在很低pH條件下DNA和RNA都會發(fā)生磷酸二酯鍵水解。 在高pH時，RNA的磷酸酯鍵易被水解

25、，而DNA的磷酸酯鍵不易被水解。,第四節(jié) 核酸的物理化學(xué)性質(zhì),一、核酸的水解酸堿水解,2-核苷酸3-核苷酸 混合物,包括核酸水解酶、合成酶、連接酶等。,（一）核酸水解酶的分類,1底物：核糖核酸酶（ribonuclease, RNase）,脫氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease, DNase）,2作用方式：核酸內(nèi)切酶（endonuclease）,3按磷酸二酯鍵斷裂的方式,4其它：如雙鏈酶、單鏈酶等,核酸外切酶（exonuclease）,（二）核糖核酸酶類,1牛胰核糖核酸酶（pancreatic ribonuclease, 簡稱RNase A或RNase I）,2核糖核酸酶T1（rib

26、onuclease T1，簡稱RNase T1）,3核糖核酸酶T2（ribonuclease T2，簡稱RNase T2）,主要作用點為Ap殘基，水解速度AUGC,（三）脫氧核糖核酸酶,1牛胰脫氧核糖核酸酶 （pancreatic deoxyribonuclease簡稱DNase I）,2牛脾脫氧核糖核酸酶 （spleen deoxyribonuclease, 簡稱DNase II）,3限制性內(nèi)切酶（restriction endonuclease） 簡稱限制酶,限制性內(nèi)切酶主要降解外源的未經(jīng)特殊修飾的DNA，對自身起了保護(hù)作用。,（1）限制性內(nèi)切酶的特征, 具有嚴(yán)格的堿基專一性，有專一的識別

27、順序、切點, 粘性未端，平末端,（2）限制性內(nèi)切酶的命名,EcoRI 屬名（第一個字母）、種名（前兩個字母）、菌株、編號,（3）限制性內(nèi)切酶舉例,（1）一般物理性質(zhì)： DNA為白色纖維狀固體，RNA為白色粉末；都微溶于水，不溶于一般有機溶劑。常用乙醇從溶液中沉淀核酸。,（2）兩性解離：堿基（嘌呤、嘧啶化合物雜環(huán)中的N） 磷酸的解離 DNA的酸堿變性使酸堿滴定曲線不可逆,二、核酸的物理化學(xué)性質(zhì),（3）紫外吸收性質(zhì),胞嘧啶核苷酸的解離,核苷酸的兩性解離和等電點,堿基的紫外吸收,由于核酸中堿基的共軛雙鍵，所以對紫外有強烈吸收，最大吸收峰在260nm附近，利用這一特性可進(jìn)行核酸的定量測定。,紫外分光光

28、度法,首先根據(jù)A260/A280的比值判斷核酸樣品的純度,純DNA：A260/A280=1.8 純RNA：A260/A280=2.0,（若樣品中含有雜蛋白或苯酚，則A260/A280比值明顯降低）,純的核酸樣品可根據(jù)260nm的光吸收值算出其含量,若260nm光吸收值為1相當(dāng)于50g/ml雙螺旋DNA,或相當(dāng)于40g/ml單鏈DNA或RNA,或相當(dāng)于20g/ml寡核苷酸。,摩爾磷消光系數(shù)（molar absorptivity）法,A：樣品的光吸收值,C：每升溶液中磷的摩爾數(shù),L：光徑,在pH7.0時；DNA的 為6600, RNA的 為77007800。,：摩爾磷消光系數(shù)，也稱摩爾磷吸光系數(shù),

29、知道了磷的含量就可知核酸的含量,增色效應(yīng)與減色效應(yīng),增色效應(yīng)（hyperchromic effect）：核苷酸以及單鏈多核苷酸的 值比雙螺旋結(jié)構(gòu)的多核苷酸的 值要高，所以核酸發(fā)生變性時， 升高，此現(xiàn)象稱為增色效應(yīng)。,減色效應(yīng)（hypochromic effect）： DNA復(fù)性后， 又 降低，這種現(xiàn)象稱減色效應(yīng),（四）核酸的變性、復(fù)性和雜交,1變性（denaturation）,核酸變性的概念,引起核酸變性的因素,（1）熱變性,結(jié)構(gòu)：螺旋線團(tuán),理化性質(zhì)：紫外吸收 粘度比旋光度,生物活性：生物活性或喪失,（2）熔點（Tm）,Tm: 熔點，熔解溫度， 變性溫度，解鏈溫度 DNA熱變性過程中，紫外吸收

30、值增高，有一個特征性曲線稱熔解曲線，通常將熔解曲線的中點，即紫外吸收值達(dá)到最大值50%時的溫度稱為解鏈溫度，又叫熔點（Tm）。,（3）影響Tm值的因素, DNA的均一性, DNA中G-C對的含量,經(jīng)驗式: (G-C)%=(Tm-69.3)2.44, 鹽離子強度,2復(fù)性（renaturation）,（1）復(fù)性,理化性質(zhì): 比旋光度 粘度,復(fù)性 也稱退火,生物活性得到部分恢復(fù),（2）影響復(fù)性的因素, DNA的濃度, DNA片段的大小,溫度,DNA的組成特點,Cot :,時的Cot值，即指復(fù)性完成一半時的Cot值。,C0：t=0時，起始DNA的濃度（mol/L）,C：t時間時，單鏈DNA的濃度（mo

31、l/L）,復(fù)性快慢由 來表示。,Cot :,3雜交（hybridization）,核酸的雜交：是指不同來源的單鏈核酸之間可通過 堿基互補形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。,單鏈DNA與單鏈DNA雜交（DNA-DNA）,利用核酸雜交可檢測特定的核苷酸片段或研究同源性等。,單鏈DNA與單鏈RNA雜交（DNA-RNA）,單鏈RNA與單鏈RNA雜交（RNA-RNA）,用硝酸纖維素膜作為支持物進(jìn)行雜交,1975年英國E. M. Southern首創(chuàng)的Southern blotting（Southern印跡）,原理,方法,探針：作為檢測用的已知DNA序列或RNA序列的片段,1977年G.K.Stark首創(chuàng)Northern

32、blotting （Northern印跡）,Western blotting（Western 印跡）,第五節(jié) 核酸的分離、純化和核苷酸的制備,（一）核酸的分離、提取通則,為了得到完整的大分子核酸，一般要注意3點 :,1保持低溫（04）。,2防止過酸、過堿，避免劇烈攪拌。,3防止核酸酶的作用。,抑制DNase：,可加檸檬酸鈉、EDTA等金屬螯合劑；或加去污劑 十二烷基硫酸鈉（SDS）；或加蛋白變性劑。,抑制RNase：,（1）實驗器皿高溫，或高壓滅菌，不能高壓滅菌的用 具用0.1%二乙基焦碳酸鹽（diethyl pyrocarbonate, DEPC）處理。,（2）加強的蛋白變性劑如硫氰酸胍、異

33、硫氰酸胍等。,（3）加核糖核酸酶阻抑蛋白（RNasin）等RNase的抑制劑。,（二）大分子DNA的提取,1材料的選擇,2細(xì)胞破碎 1.機械法：根據(jù)固體剪切作用分：珠磨法，壓榨法 根據(jù)液體剪切作用分：高壓勻漿法，超聲破碎法 2.非機械法：干燥法 溶胞作用：酶溶解法，化學(xué)滲透法，物理法（滲透壓法，反復(fù)凍融法）,3DNA-蛋白質(zhì)（DNP）的提取,真核細(xì)胞DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合成核蛋白（DNP），RNA與蛋白質(zhì)結(jié)合成RNP，而且DNP和RNP常?；煸谝黄稹＠肈NP和RNP在不同濃度NaCl中溶解度的不同來分離DNP和RNP。,可用1mol/LNaCl溶液提取DNP。,相 對 溶 解 度,NaCl（mo

34、l/L）,DNP在NaCl中的溶解度,4去蛋白質(zhì),（1）SDS,（2）苯酚法,（3）氯仿法,（4）酚:氯仿:異戊醇25:24:1,5沉淀DNA,6去雜質(zhì),（1）去RNA,（2）去多糖,7進(jìn)一步純化,生物材料,DNP（RNP）,DNP,纖維狀DNA,較純DNA,純DNA,*原核生物的DNA是裸露的，與蛋白質(zhì)結(jié)合不多，分離純化要簡單些。,破細(xì)胞,1.0mol/L NaCl*,去蛋白質(zhì),酒精沉淀,去RNA,柱層析，電泳,密度梯度離心,去多糖,（四）核酸純度鑒定,1.A260/A280,2.電泳,（五）核酸含量的測定,1.定磷法：鉬藍(lán)比色法,2.定糖法：,3.紫外吸收法,若260nm光吸收值為1相當(dāng)于50g/ml雙螺旋DNA,或相當(dāng)于40g/ml單鏈DNA或RNA,核酸的構(gòu)象和分離,：超螺旋DNA環(huán)狀DNA線狀DNA蛋白質(zhì),DNA 沉降,（六