基因結(jié)構(gòu)分析的基本策略分析(PPT 79頁).ppt

1、第二十五章基因結(jié)構(gòu)分析的基本策略,Basic strategy for analyzing gene structure,主要內(nèi)容： 第一節(jié) 基因序列結(jié)構(gòu)的生物信息學(xué)檢索和比對 分析 第二節(jié) 基因轉(zhuǎn)錄起始點的鑒定 第三節(jié) 啟動子的結(jié)構(gòu)及功能分析 第四節(jié) 編碼序列結(jié)構(gòu)分析,第一節(jié) 基因序列結(jié)構(gòu)的生物信息學(xué)檢索和比對分析,就是在數(shù)據(jù)庫中對基因序列或DNA序列進(jìn)行 比對分析，以其能夠推測出其結(jié)構(gòu)、功能及在進(jìn)化上的聯(lián)系. 比對方法： 1. 雙重比對 2. 多序列比對,序列比對目的： 判斷兩個或多個序列間是否具有足夠的相似性 從而判斷二者之間是否具有同源性,直接的數(shù)量關(guān)系,進(jìn)化上曾具有共同祖先,基因或D

2、NA序列比對,序列比對的結(jié)果： 取代 插入 缺失,Mouse: GGKDSCQGDSGGPVVCNG-QLQGVVSWGDGCAQKNKPGVYTKVYNYVKWIKNTIAAN Crayfish: GGKDSCQGDSGGPLAASDTGSTYLAGIVSWGYGCARPGYPGVYTEVSYHVDWIKANAV-,缺失？,保守序列,保守序列： 可能是共同進(jìn)化的標(biāo)志 可能并不代表功能的重要性,插入？,當(dāng)兩個序列非常相似時，是否一定說明它們具有相似的功能？,NCBI數(shù)據(jù)庫,NCBI首先創(chuàng)建GenBank數(shù)據(jù)庫,于1991年開發(fā)了Entrez數(shù)據(jù)庫檢索系統(tǒng)，該系統(tǒng)整合了GenBank、EMBL、

3、PIR和SWISS-PROT等數(shù)據(jù)庫的序列信息以及MEDLINE有關(guān)序列的文獻(xiàn)信息，并通過相關(guān)鏈接，將他們有機地結(jié)合在一起 NCBI還提供了其他數(shù)據(jù)庫，包括在線人類孟德爾遺傳(OMIM）、三維蛋白結(jié)構(gòu)的分子模型數(shù)據(jù)庫（MMDB）、人類基因序列集成（UniGene）、人類基因組基因圖譜（GMHG）、生物門類（Toxonomy） 等數(shù)據(jù)庫,1. 各種數(shù)據(jù)庫的介紹,(1) Nucleotide,該數(shù)據(jù)庫由國際核苷酸序列數(shù)據(jù)庫成員美國國立衛(wèi)生研究院GenBank、日本DNA數(shù)據(jù)庫(DDBJ)和英國Hinxton Hall的歐洲分子生物學(xué)實驗室數(shù)據(jù)庫(EMBL）三部分?jǐn)?shù)據(jù)組成 三個組織每天交換各自數(shù)據(jù)庫

4、中的新增序列實現(xiàn)數(shù)據(jù)共享,(2) Genome,即基因組數(shù)據(jù)庫，提供了多種基因組、完全染色體、重疊序列圖譜以及一體化基因物理圖譜,(3) Structures,即結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫或稱分子模型數(shù)據(jù)庫(MMDB)，包含來自X線晶體學(xué)和三維結(jié)構(gòu)的實驗數(shù)據(jù),NCBI已經(jīng)將結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)交叉鏈接到書目信息、序列數(shù)據(jù)庫和NCBI的Taxonomy中運用NCBI的3D結(jié)構(gòu)瀏覽器和Cn3D，可以很容易地從Entrez獲得分子的分子結(jié)構(gòu)間相互作用的圖像,(4) Taxonomy,即生物學(xué)門類數(shù)據(jù)庫，可以按生物學(xué)門類進(jìn)行檢索或瀏覽其核苷酸序列、蛋白質(zhì)序列、結(jié)構(gòu)等,(5) PopSet,包含研究一個人群、一個種系發(fā)生或描述人群

5、變化的一組組聯(lián)合序列 PopSet既包含了核酸序列數(shù)據(jù)又包含了蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù),(7) 文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫,PubMed：生物醫(yī)藥科學(xué)的檢索系統(tǒng) OMIM：孟德爾遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫是人類基因和基因疾病的目錄數(shù)據(jù)庫 其他：書目，雜志，文章引用匹配等,該數(shù)據(jù)庫包括原文信息、圖片和參考信息，同時還可以鏈接到Entrez系統(tǒng)MEDLINE數(shù)據(jù)庫中相關(guān)文獻(xiàn)和序列信息,2. NCBI數(shù)據(jù)庫檢索,在檢索框中輸入檢索詞，檢索詞間默認(rèn)邏輯關(guān)系為AND，檢索規(guī)則基本同PubMed,可以通過下拉菜單選擇記錄的顯示格式，通常選擇GenBank Report格式或FASTA Report格式。 當(dāng)選擇GenBank Report格式后

6、，屏幕顯示較完整的基因記錄，包括：基因位點(Locus）、基因定義(Definition）、基因存取號(Accession）、 核酸編號(NID ）、關(guān)鍵詞(Keywords）、 來源(Source）、組織分類(Organism)、參考文獻(xiàn)(Reference)、 著者(Author）、題目(Title）、期刊(Journal）、Medline存取號(Medline）、序列特征(Features）、基因(Gene）、CDS（cDNA）、等位基因(Allele） 對等的肽(Mat-Peptide ）、計算堿基數(shù)(Base Count）、原序列(Origin）。 而FASTA Report格式僅包

7、括檢出序列的簡要特征描述。,例如：人EPO基因序列檢索,輸入關(guān)鍵詞，選擇合適的程序,向下拉尋找符合目標(biāo)的條目,點擊此條打開連接,向下拉尋找關(guān)注的內(nèi)容,凡是連接的地方都可以點擊查看,可以直接拷貝保存相關(guān)內(nèi)容,Entrez： 是一個用以整合NCBI數(shù)據(jù)庫中信息的搜尋和檢索工具,3. NCBI數(shù)據(jù)庫搜索工具,BLAST： 是一個NCBI開發(fā)的序列相似搜索程序，還可作為鑒別基因和遺傳特點的手段,NCBI提供的附加軟件工具有：開放閱讀框?qū)ひ捚鳎∣RF Finder），電子PCR，和序列提交工具，Sequin和BankIt,Entrez的一個強大和獨特的特點是檢索相關(guān)的序列，結(jié)構(gòu)，和參考文獻(xiàn)的能力,Ent

8、rez:,BLAST:,BLAST程序,點擊核酸序列blast，在框內(nèi)輸入序列：,選擇搜索條件：,選擇特殊程序：,比較兩個序列之間的相似性：,以上僅簡介了NCBI相關(guān)數(shù)據(jù)庫及工具軟件關(guān)于其他數(shù)據(jù)庫及軟件工具等信息見書中第二十五章表1-5。,第二節(jié) 基因轉(zhuǎn)錄起始點的鑒定,主要內(nèi)容： 一、基因轉(zhuǎn)錄起始點的序列特征 二、基因轉(zhuǎn)錄起始點的序列分析,一、基因轉(zhuǎn)錄起始點的序列特征,1. 真核基因及其調(diào)控元件,II 型啟動子的TSS： 沒有明確的保守序列 有一種趨勢，即mRNA 的第一個堿基是A，其側(cè)翼堿基傾向于是嘧啶 與mRNA第一個堿基對應(yīng)的位置標(biāo)記為-1區(qū) -3 +5區(qū)域被稱作起始子 (initiat

9、or),2. 轉(zhuǎn)錄起始點（TSS）,Py2CAPy5,二、基因轉(zhuǎn)錄起始點的序列分析,思考： 轉(zhuǎn)錄起始點 (TSS)位于基因編碼序列的5端 基因編碼區(qū)是指能體現(xiàn)在多肽鏈中的核苷酸序列 多肽鏈?zhǔn)且詍RNA為模板經(jīng)翻譯合成的,因此， 分析鑒定TSS的方法都是以cDNA為切入點,1. cDNA克隆測序,AAAAAn,AAAAAn,mRNA,反轉(zhuǎn)錄酶,AAAAAn,Oligo (dT)15-18,cDNA第一鏈,CCCCC,cDNA第一鏈,nCCCC,nGGGG,cDNA第二鏈,克隆擴增，5端測序分析,反轉(zhuǎn)錄酶的末端轉(zhuǎn)移酶活性 Oligo (dG)15-18,mRNA,與線性載體相連接,要求： cDNA

10、的5端完整無缺,2. cDNA末端快速擴增技術(shù)(RACE),傳統(tǒng)的RACE：,mRNA,cDNA,mRNA,-5,3-,反轉(zhuǎn)錄酶,Oligo (dT)15-18,末端轉(zhuǎn)移酶,dGTP,nGGGGG,錨定PCR擴增,nGGGGG,nCCCCC,錨定引物,特異引物,PCR產(chǎn)物,Deep-RACE：,用寡核苷酸替代mRNA的5端帽結(jié)構(gòu)以及發(fā)光標(biāo)記巢氏PCR引物實現(xiàn)高通量鑒定轉(zhuǎn)錄起始點,5-p 帽,mRNA,牛小腸磷酸酶 (CIP),5-帽,煙草酸焦磷酸酶 (TAP),5-,將5-RACE adaptor (寡核苷酸)加到脫帽RNA分子上,5-RACE adaptor (寡核苷酸),反轉(zhuǎn)錄酶 10nt

11、 隨機引物,5-RACE adaptor,5-RACE adaptor,5-RACE adaptor,5-RACE adaptor,長短不同的cDNA,隨機引物,用10nt隨機引物與5-RACE引物進(jìn)行PCR擴增,5-RACE adaptor,5-RACE adaptor,5-RACE adaptor,5-RACE adaptor,PCR產(chǎn)物,隨機引物,以5-RACE引物和5端甩尾的基因特異性反向引物進(jìn)行巢氏PCR,5-RACE adaptor,以5-RACE發(fā)光標(biāo)記引物對PCR混合物直接進(jìn)行一次性測序,分析基因轉(zhuǎn)錄起始點,3.連續(xù)分析基因轉(zhuǎn)錄起始點,在RACE的基礎(chǔ)上，通過在轉(zhuǎn)錄本5 端引入

12、一個特殊的II型限制性核酸內(nèi)切酶識別位點，實現(xiàn)了基因5 端短片段串聯(lián)連接產(chǎn)物一次測序分析多個基因轉(zhuǎn)錄起始點的目的 主要有兩種方法： 5 端連續(xù)分析基因表達(dá)（5 -end serial analysis of gene expression, 5 SAGE） 帽分析基因表達(dá)（cap analysis gene expression, CAGE）,(1) 5 SAGE,5SAGE是在PCR過程中將MmeI酶切位點引物cDNA的5端，通過酶切和連接獲得不同短片段重復(fù)序列，并對重復(fù)序列進(jìn)行測序獲得大量片段序列信息 不同序列的短片段代表不同基因的轉(zhuǎn)錄起始點 (TSS),MmeI: 是一種特殊的II型限制

13、性核酸內(nèi)切酶 識別的序列不是回文結(jié)構(gòu)，而是不對稱的DNA序列5-TCCRAC-3（R代表G或A） 在識別位點下游1820堿基處切開雙鏈DNA,Gppp,AAAAAAAAn,mRNA,用BAP和TAP處理,AAAAAAAAn,p,在RNA的5端加上寡核苷酸帽,AAAAAAAAn,XhoI,MmeI,反轉(zhuǎn)錄酶,RT,AAAAAAAAn,cDNA,PCR,Biotin-標(biāo)記引物,隨機引物,Biotin,MmeI,酶切消化,20 mer,親和素,用親和素-生物素，可以將5-端片段與其他片段分離開,20 mer,連接,20 mer,PCR擴增,XhoI,酶切消化,自身連接,串聯(lián)體,測序分析,(2) CA

14、GE,CAGE與5SAGE非常相似 所不同的是: CAGE不需要在RNA上加接頭，而是用oligo(dT)引物先進(jìn)行第一鏈cDNA的合成 然后通過捕獲帽結(jié)構(gòu)，將含有MmeI和另一內(nèi)切酶位點如XmaJI的linker加到單鏈全長cDNA的3末端,AAAAAAn,Cap,mRNA,反轉(zhuǎn)錄酶,Oligo (dT)1518,AAAAAAn,Cap,TTTTTTTn,cDNA,捕獲5-帽結(jié)構(gòu),單鏈linker,連接,TTTTTTTn,Biotin,cDNA第二鏈的合成,TTTTTTTn,AAAAAAn,MmeI,XmaJI,MmeI,酶切,親和素,20 mer,用親和素-生物素，可以將5-端片段與其他片

15、段分離開,連接第二個linker,XbaI,XmaJI,XmaJI, Xbal,酶切消化,PCR（用linker1和linker2作引物）,Linker 1,Linker 2,純化，串聯(lián)連接，克隆,20 mer,XmaJI和XbaI是同尾酶： XmaJI：CCTAGG XbaI： TCTAGA,串聯(lián)體,測序分析,第三節(jié) 啟動子的結(jié)構(gòu)及功能分析,主要內(nèi)容： 一、啟動子的結(jié)構(gòu)分析 二、啟動子的功能分析,啟動子（promoter） 是一段能被蛋白質(zhì)識別的、參與特定基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的DNA序列 II型啟動子通常位于結(jié)構(gòu)基因的上游 共通序列(consensus sequence)是其特征性序列,共通序列和啟

16、動子所處的位置是研究啟動子的重要線索,共通序列,例如： 原核基因的共通序列： -10區(qū)：Pribnow box（T77A76T60A61A56T82序列） -35區(qū)：T69T79G61A56C54A54 序列 真核基因的共通序列： 真核基因啟動子在-50區(qū)域附近（大約5%30%基因啟動子在-25-30區(qū)域）有TATA box（TATAAA序列）,TATAAT,TTGACA,一、啟動子的結(jié)構(gòu)分析,主要方法： 利用PCR技術(shù)克隆啟動子 利用核酸-蛋白質(zhì)相互作用方法研究啟動子 生物信息學(xué)預(yù)測啟動子,（一）利用PCR技術(shù)克隆啟動子,特異性基因序列,基因上游序列,基因組DNA,根據(jù)基因序列合成一條反向引

17、物 正向引物用隨機引物,PCR擴增,隨機引物,特異引物,克隆及測序分析,注意： 真核基因有內(nèi)含子，應(yīng)該根據(jù)mRNA序列設(shè)計特異性引物 特異性引物盡可能靠近基因的5端,1. 根據(jù)已知基因序列直接進(jìn)行PCR擴增,2. 利用TSS釣取啟動子,AAAAAAn,Cap 5-,mRNA,反轉(zhuǎn)錄,AAAAAAn,TTTTTTn,cDNA,插入載體，克隆擴增,Cap 5-,以基因特異引物與載體引物配對,PCR擴增,5-,測序分析基因轉(zhuǎn)錄起始點序列,以TSS序列為引物，基因組序列為模板，與隨機引物配對進(jìn)行TSS上游序列的PCR擴增,3. 利用環(huán)狀PCR釣取啟動子,基因組DNA,酶切消化,基因組DNA片段,直接環(huán)

18、化連接,加上接頭后環(huán)化連接,根據(jù)基因上游序列設(shè)計一對反向互補引物,PCR擴增,根據(jù)接頭序列設(shè)計引物,PCR擴增,克隆 測序分析,克隆 測序分析,加接頭環(huán)化PCR不依賴特異基因序列 可用于篩選啟動子,接頭,（二）利用核酸-蛋白質(zhì)互作方法研究啟動子,啟動子是一段能被蛋白質(zhì)識別和結(jié)合的DNA序列，因此，能夠檢測核酸-蛋白質(zhì)相互作用的研究方法都可以用于啟動子的研究中,主要方法： 足跡法（酶足跡法，化學(xué)足跡法） 電泳遷移率變動實驗（EMSA） 染色體免疫沉淀（ChIP）,1. 用足跡法研究啟動子,足跡法（Footprinting） 利用DNA電泳條帶連續(xù)性中斷的圖譜特點判斷與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA區(qū)域,基本

19、流程：,DNA與蛋白質(zhì)相互作用,切割DNA,凝膠電泳,分析電泳圖譜,（1）酶足跡法 (Enzymatic footprinting),利用能切割DNA的酶處理DNA-蛋白質(zhì)混合物，然后通過電泳進(jìn)行分析,DNase I足跡法 (DNase I footprinting),是一種利用DNase I 隨機切割雙鏈DNA，從而確定DNA結(jié)合蛋白在DNA上結(jié)合位點的方法,核酸外切酶III足跡法 (Exonucleoase III footprinting),是利用核酸外切酶III（Exo III）的35外切酶活性從3末端切割雙鏈DNA的特性，確定蛋白質(zhì)在DNA上的結(jié)合位點的常用方法,DNase I 足跡

20、法,dsDNA,單鏈末端標(biāo)記,DNA結(jié)合蛋白,DNase I,酶切消化 （控制反應(yīng)時間）,產(chǎn)生長短不同的片段 但蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)被保護,蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū),M,No-pro,Pro-DNA,對在凝膠上出現(xiàn)空白區(qū)域的DNA進(jìn)行克隆測序，即可確定結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA序列,變性凝膠電泳,（2）化學(xué)足跡法 (Chemical footprinting),是利用能切斷DNA骨架的化學(xué)試劑處理DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，從而通過化學(xué)試劑無法接近結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA區(qū)域而確定DNA的蛋白質(zhì)結(jié)合位點 主要方法： 羥自由基足跡法 體內(nèi)足跡法,1）羥自由基足跡法 （Hydroxyl radical footprinting）,化學(xué)試

21、劑,羥自由基,利用化學(xué)試劑產(chǎn)生的羥自由基攻擊DNA分子表面脫氧核糖骨架使DNA斷裂 當(dāng)DNA結(jié)合蛋白將脫氧核糖遮蓋時，自由羥基無法攻擊而使這個區(qū)域的DNA受到保護,電泳圖譜上出現(xiàn)空白區(qū)的地方就是結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA,變性凝膠電泳,2）體內(nèi)基足跡法 （In vivo footprinting）,用化學(xué)試劑對活細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)處理，使DNA在細(xì)胞內(nèi)受到化學(xué)修飾，然后裂解細(xì)胞，用化學(xué)法或酶法進(jìn)行足跡實驗。,甲基化干擾實驗 (Methylation interference assay) 是利用化學(xué)試劑如硫酸二甲酯（Dimethyl sulfate, DMS）對活細(xì)胞DNA進(jìn)行甲基化修飾，從而干擾蛋白質(zhì)與D

22、NA的結(jié)合。,乙基化干擾實驗 (Ethylation interference assay) 是利用化學(xué)試劑對活細(xì)胞DNA進(jìn)行乙基化修飾，從而干擾蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合。,化學(xué)試劑,提取DNA,DNase I 或化學(xué)試劑,變性凝膠電泳分析,切割DNA,化學(xué)修飾對蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合有干擾，因此，體內(nèi)足跡實驗也叫干擾實驗 電泳圖譜需與未修飾的DNA樣品進(jìn)行比較，在未修飾樣品中出現(xiàn)空白區(qū)的位置是體內(nèi)發(fā)生化學(xué)修飾的DNA區(qū)域,正常對照,化學(xué)修飾,提取DNA,2. 用電泳遷移率變動實驗研究啟動子,電泳遷移率變動實驗 (Electrophoretic mobility shift assay, EMSA)

23、 是利用結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA片段在凝膠中遷移滯后的特點，通過電泳分離研究核酸-蛋白質(zhì)互作的方法 又稱為凝膠阻滯實驗(Gel retardation assay),細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物,標(biāo)記的DNA片段,蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合,蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物電泳遷移滯后,凝膠電泳,顯影,滯后條帶表明DNA是與蛋白質(zhì)結(jié)合的區(qū)域,3.用染色體免疫沉淀技術(shù)研究啟動子,染色體免疫沉淀 (Chromatin immunoprecipitation, ChIP) 是在保持蛋白質(zhì)與染色體DNA結(jié)合的同時，將染色體切割成小片段并沉淀下來,非變性ChIP：是先用核酸酶處理細(xì)胞核，將染色體消化成碎片，然后用合適的抗體將結(jié)合有蛋白質(zhì)的染

24、色體片段通過免疫沉淀選擇出來，再以PCR或核酸雜交技術(shù)對DNA序列進(jìn)行分析 變性ChIP：是先用甲醛處理細(xì)胞，使蛋白質(zhì)與DNA在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生交聯(lián)，然后分離染色體并進(jìn)行剪切，用特異性抗體與DNA結(jié)合蛋白相結(jié)合，以沉淀法分離DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體,前面章節(jié)已介紹，這里不再詳述,（三）生物信息學(xué)預(yù)測啟動子,真核基因組的測序正在以不斷增長的速度進(jìn)行著，目前已經(jīng)可以獲得大約50個完整真核生物基因組的序列信息， 預(yù)計在未來幾年內(nèi)將會完成更多的基因組測序工作 對基因組注釋工作中最難的就是精確鑒定和描繪啟動子，因此，啟動子的預(yù)測就顯得非常重要,預(yù)測啟動子的切入點 啟動子的結(jié)構(gòu)特征 啟動子在染色體上的位置,1. 啟

25、動子的結(jié)構(gòu)特征,典型啟動子 核心啟動子：一般在TSS上游-35區(qū)域以內(nèi) 近端啟動子：一般涉及TSS上游幾百個堿基 遠(yuǎn)端啟動子：一般涉及TSS上游幾千個堿基 含有增強子或沉默子,一些特征性的結(jié)構(gòu) TSS附近的CG島經(jīng)常出現(xiàn)在啟動子中 共通序列 (consensus sequence),2. 啟動子的預(yù)測分析,EPD (Eukaryotic promoter databases) TRRD (Transcription regulatory regions databases) 基因轉(zhuǎn)錄起始點數(shù)據(jù)庫 (DBTSS),啟動子數(shù)據(jù)庫,這些數(shù)據(jù)庫主要通過計算機識別、判斷及分析，在數(shù)據(jù)庫中尋找啟動子的特異

26、性特征結(jié)構(gòu)。,二、啟動子的功能分析,啟動子通常是基因上游參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的DNA序列。由于啟動子中的順式作用元件在基因的特異性表達(dá)中發(fā)揮重要作用，因此，可以通過連接報告基因研究啟動子的功能。,1. 報告基因 (Reporter gene),是研究者們?yōu)榱酥圃煲环N可在細(xì)胞培養(yǎng)條件下或動植物體內(nèi)作為篩選標(biāo)志的易檢測信號，通過分子生物學(xué)操作將發(fā)光蛋白或酶的編碼基因附加到一個感興趣基因上或插入基因調(diào)控序列下游，從而監(jiān)測感興趣基因的表達(dá)或分析基因調(diào)控序列的活性 。,常用的報告基因,熒光蛋白編碼基因： 綠色熒光蛋白 (GFP) 紅色熒光蛋白 (dsRed) 蛋白酶： 熒光素酶 (luciferase) -

27、半乳糖苷酶,在藍(lán)色光源照射下發(fā)綠光,能催化熒光素 (luciferin)發(fā)生氧化反應(yīng)發(fā)光,能使細(xì)菌在X-gal存在條件下變成藍(lán)色,2. 報告基因的應(yīng)用,監(jiān)測基因的轉(zhuǎn)染效率 報告基因與目的基因分別插入各自啟動子下游，實現(xiàn)報告基因的組成性表達(dá)模式 監(jiān)控目的基因的表達(dá) 報告基因與目的基因融合共同受控于一個啟動子，報告基因的表達(dá)即代表目的基因的表達(dá) 研究啟動子的活性 報告基因插入被研究啟動子下游，通過觀察報告基因的表達(dá)情況推測啟動子活性,啟動子捕獲技術(shù) (promoter trapping)：是一種研究啟動子活性的篩選方法 基本流程： 構(gòu)建啟動子捕獲載體 觀察報告基因的表達(dá),報告基因,MCS,ori,

28、候選啟動子序列,插入MCS,轉(zhuǎn)染細(xì)胞,觀察報告基因的表達(dá),啟動子捕獲載體,第四節(jié) 編碼序列結(jié)構(gòu)分析,編碼序列 (coding sequence)： 通常是指能體現(xiàn)在蛋白質(zhì)氨基酸序列中的基因信息,主要內(nèi)容 一、基因編碼序列的結(jié)構(gòu)特征 二、基因編碼序列的結(jié)構(gòu)分析,一、基因編碼序列的結(jié)構(gòu)特征,基因的編碼序列具有一些特征性序列 比如： 開放閱讀框架 蛋白質(zhì)翻譯的起始密碼子和終止密碼子 真核基因的外顯子（編碼序列）和內(nèi)含子（非編碼序列）之間有特殊序列,（一）開放閱讀框架,開放閱讀框架 (open reading frame, ORF) 是指生物基因組中含有能潛在編碼蛋白質(zhì)的一段核苷酸序列 在基因序列中，ORF位于起始密碼子（start codon）和終止密碼子（stop codon）之間,密碼子： 是由三個核苷酸組成的DNA序列，也稱作三聯(lián)密碼子 生物