MIC實(shí)驗(yàn)教案參考幻燈片.ppt

1、幾種抗菌藥物的最小抑菌濃度的測定MIC試驗(yàn) （微量肉湯二倍稀釋法）,1,一、目的,1、掌握微量肉湯二倍稀釋法測定抗菌藥物MIC的基本步驟，能準(zhǔn)確測出各種抗菌藥物的MIC值，了解單藥的抗菌活性 2、為后面的棋盤法設(shè)計(jì)棋盤做準(zhǔn)備，求取棋盤的中心濃度,2,二、意義,1、通過對MIC值的測定了解藥物的體外抗菌活性 2、為臨床選藥提供依據(jù) 3、耐藥檢測,3,三、菌種,1、大腸桿菌（標(biāo)準(zhǔn)菌株25922） 2、沙門氏菌（標(biāo)準(zhǔn)菌株） 3、金色葡萄球菌（標(biāo)準(zhǔn)菌株） （以上三種菌株均由中國獸藥監(jiān)察所提供）,4,四、藥品,硫酸慶大霉素（批號： 含量： 廠家： ） 阿莫西林（批號： 含量： 廠家： ） 硫酸四環(huán)素（批

2、號： 含量： 廠家： ） 恩諾沙星（批號： 含量： 廠家： ） 阿米卡星（批號： 含量： 廠家： ） 氟苯尼考（批號： 含量： 廠家： ）,5,五、培養(yǎng)基,MH肉湯培養(yǎng)基、用去離子水配制5g/L顯色劑TTC（氯化三苯四氮唑）,6,六、器材,96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿、移液槍、 1ml和200 l槍頭、EP管、錐形瓶、試管架、酒精燈、酒精棉球等 分析天平、超凈工作臺、37度恒溫培養(yǎng)箱、烘箱,7,七、方法步驟,1、藥液的配制及除菌 配制 根據(jù)藥物的效價(jià)或是含量及所需要的體積，計(jì)算出藥物所需的量，并準(zhǔn)確稱取所需的各種抗菌藥物，用適宜的溶劑及稀釋及稀釋劑將藥物稀釋至所需的濃度。 除菌 抗菌素藥物通過過濾

3、的方式過濾；化學(xué)合成類藥物通過過濾或是高壓滅菌的方式進(jìn)行除菌。,8,2、不同的抗菌藥物原液配制所需的溶劑 溶劑為PH4.5PBS緩沖液的：四環(huán)素類 溶劑為PH6.0PBS緩沖液的：青霉素G，半合成青霉素類，頭孢菌素類，多粘菌素B硫酸鹽 溶劑為PH7.8PBS緩沖液的：氨基糖苷類，林可或氯林可霉素,9,3、MIC的測定（微量二倍稀釋法） 第一步：在96孔板每個(gè)孔加入含TTC的空白肉湯100l 。 圖表,10,第二步：在A/B/C三排的第一孔加配好的藥液A(濃度為512IU/ml或g/ml)100 l，然后對藥物進(jìn)行二倍稀釋。即，第一孔中加入藥液后用移液槍充分吹打（至少三次以上）使藥物與肉湯充分混

4、勻，然后吸取100l加入第二孔再充分吹打使之與肉湯充分混勻，照此重復(fù)直至最后一孔，吸取100l棄去;此時(shí)每孔藥物濃度從左到右依次為：256，128，64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25，0.125(單位:IU/ml或g/ml) 圖表,11,第三步：再在每一孔中加入稀釋好的菌液100l,這樣就形成測定一個(gè)藥物MIC值的三次重復(fù)（A/B/C三排樣品）。此時(shí)每孔藥物濃度即最終藥物濃度從左到右依次為： 128，64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25，0.125，0.06(單位:IU/ml或g/ml)； 圖表,12,第四步：在同一塊板上的G排上做一排陰性對照（僅加空白肉湯不加菌

5、液）和在H排上做一排陽性對照（加菌液不加藥液） 第五步：將96孔板放入37度恒溫培養(yǎng)箱1620小時(shí)后，觀察結(jié)果。 圖表,13,第一步 第二步 第三步 第四步,14,八、觀察及判斷結(jié)果,1、若有菌生長TTC會顯示紅色；若沒有細(xì)菌生長TTC則不變色。 2、MIC值的判定：96孔板上橫排中未變紅色的最后一孔所對應(yīng)的濃度便為該藥的MIC值。 3、觀察所做的陰性對照和陽性對照結(jié)果 4、記錄結(jié)果并將每種藥物的MIC值報(bào)告老師,15,九、注意事項(xiàng)：,1、無菌操作 除移液槍和96孔板外其他所有用具都需經(jīng)過高壓滅菌處理 超凈臺使用前后都需打開紫外燈進(jìn)行消毒；不能拿酒精面球球擦擋板！ 操作前洗手，用酒精棉球擦手

6、每次槍頭過瓶口，瓶口都要經(jīng)火焰燒過；移液槍和槍頭不能在究竟燈上烤！ 操作過程中加液盡可能不將96孔板蓋完全打開,16,2、其他注意事項(xiàng)： （1）培養(yǎng)板上用標(biāo)簽紙做好標(biāo)記，寫明組別，做什么菌、什么藥，以及各組對照。 （2）每藥做三個(gè)重復(fù)，每個(gè)板做一個(gè)陰性對照和一個(gè)陽性對照。 （3）廢液缸，超凈臺內(nèi)用過的不需要的東西都必須放到廢液缸內(nèi)，不能在臺面亂扔。 （4）實(shí)驗(yàn)完后要收拾好臺面，所有公用設(shè)施恢復(fù)原位。,17,十、記錄結(jié)果的格式,例如：菌對藥的MIC值（g/ml或是UI/ml）,18,十一、討論,1、微量肉湯二倍稀釋法應(yīng)注意那些環(huán)節(jié)才能準(zhǔn)確測定MIC？ 2、MIC試驗(yàn)對臨床選藥的意義以及它的局限性？ 3、TTC的作用機(jī)理？,19,十二、分組,整個(gè)班分為6個(gè)組，每組11人。 1、2組做8種藥對大腸桿菌的最小抑菌濃度 3、4組做8種藥對沙門氏菌的最小抑菌濃度 5、6組做8種藥對金色葡萄球菌的最小抑菌濃度 1、2、3組在今天上午完成實(shí)驗(yàn)，4、5、6組在下午過來完成實(shí)驗(yàn)。每個(gè)大組要做4塊96孔板，由4個(gè)同學(xué)來完成！,20,每組的物品清單,96孔細(xì)胞