微生物檢驗方法驗證方案

1、微生物限度檢查方法驗證產(chǎn)品名稱驗證方案登記號XX公司微生物限度檢查方法驗證方案目錄1. 驗證目的2.驗證小組及職責(zé)分工2.1驗證小組2.2職責(zé)分工3.驗證程序 4.驗證結(jié)論及綜合評價1. 驗證目的確認(rèn)所采用的細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法和控制菌檢查方法適合該藥品的微生物限度檢查。2.驗證小組及職責(zé)分工2.1驗證小組組長：小組成員： 2.2職責(zé)分工組長：負(fù)責(zé)驗證期間各部門的協(xié)調(diào)及整個驗證過程的具體實施。分析中心（微生物室）：負(fù)責(zé)驗證方案的起草及具體實施，確保驗證過程能按方案規(guī)定的程序進(jìn)行，對各種驗證資料（驗證結(jié)果）應(yīng)及時交與GMP組相關(guān)人員整理。GMP辦：負(fù)責(zé)驗證方案的編寫規(guī)范；負(fù)責(zé)各種驗證資料（

2、檢查結(jié)果）的收集整理及結(jié)果的審核；審查驗證報告及發(fā)放驗證報告。質(zhì)量管理部：參與驗證方案的編制；負(fù)責(zé)驗證方案的審核及批準(zhǔn)；負(fù)責(zé)出具檢驗報告；并對微生物限度檢查環(huán)境進(jìn)行檢測；負(fù)責(zé)驗證文件的管理。3驗證內(nèi)容3.1品種：XXXX；批號：。3.2培養(yǎng)基：無菌檢查用硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基，批號；霉菌液體培養(yǎng)基，批號； 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，批號；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，批號；0.1%蛋白胨溶液，批號；虎紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，批號；由中檢所培養(yǎng)基室提供。（根據(jù)檢驗要求選擇適宜的培養(yǎng)基）3.3方法：微生物限度檢查方法驗證（中國藥典2005年版）。 3.5計數(shù)方法的驗證3.5.1 驗證試驗用菌種：驗證試驗用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代

3、（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗菌株的生物學(xué)特性。a.大腸埃希菌(Escherichia coli)CMCC(B) 44 102b.金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) CMCC(B) 26 003c.枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) CMCC(B) 63 501d.白色念珠菌(Candida albicans)CMCC(F) 98 001e.黑曲霉(Aspergillus niger) CMCC(F)98 003.5.2菌液制備：接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基

4、中，白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824h；黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)57天。用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含5001000cfu的菌懸液。3.5.3 供試液制備 取供試品10g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，用勻漿儀（30005000r/min、24min）或其他適宜的方法，混勻，作為供試液。3.5.4供試液的稀釋（10倍遞增稀釋法）3.5.4.1取34支滅菌試管，分別加入9mlpH7.0的無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液。加稀釋劑后，試管塞應(yīng)立即塞上。3.5.4.2另取1支1ml滅菌吸管1：10均勻供試液1ml，加入裝9mlpH7.0

5、的無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液的試管中，混勻，即為1：100供試液，以次類推，可稀釋至試驗適宜的稀釋級（針對各品種，此處應(yīng)明確試驗所要求的稀釋級別）。每遞增1稀釋級時，必須加換一支吸管。3.5.4.3在作10倍遞增稀釋時，吸管插入第1級稀釋液內(nèi)不低于液面2.5cm，反復(fù)吸吹約10次。吸液時，應(yīng)先吸至高于吸管上部刻度少許，然后提出吸管，貼于試管內(nèi)壁，調(diào)整液量至刻度，吸管移至第2級稀釋管的內(nèi)壁近液面處（勿接觸液面），緩慢地放出全部供試液（吸管內(nèi)應(yīng)無粘附可殘留液體）。3.5.5驗證方法驗證分為四組，至少應(yīng)進(jìn)行3次獨立的平行試驗，并分別計算供試品組和對照組試驗的菌回收率。3.5.5.1試驗組取最低稀釋級的供

6、試液，按每1ml供試液加入50100cfu試驗菌，按菌落計數(shù)方法測定其菌數(shù)。平皿法計數(shù)時，取試驗菌液、供試液1ml分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平均測定法測定其菌數(shù)。3.5.5.2菌液組取上述試驗菌液，測定所加入的試驗菌菌數(shù)。3.5.5.3供試品對照組取最低稀釋級的供試液1ml，接菌落計數(shù)方法測定其所含菌數(shù)。3.5.5.4稀釋劑對照組為考察供試液制備過程對微生物的影響程度，用相應(yīng)的稀釋液替代供試液，加入試驗菌，使最終菌濃度為每1ml含50100cfu，按試驗組的供試液制備方法和菌落計數(shù)方法測定其菌數(shù)。3.5.5.5試驗組的菌回收率（%）=3.5.5.6稀釋劑

7、對照組的菌回收率（%）=3.5.6結(jié)果判定稀釋劑對照組的菌回收率均應(yīng)不低于70%。若試驗組的菌回收率均不低于70%，則可按該供試液的制備方法和菌落計數(shù)法測定供試品的細(xì)菌、霉菌和酵母菌數(shù)；若任一次試驗中試驗組的菌回收率低于70%，應(yīng)建立新的方法，消除供試品的抑菌活性，并重新驗證。3.5.7驗證過程記錄表1 菌液組的平均菌落數(shù)（cfu/ml） 實驗次數(shù)金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉大腸埃希菌123表2 稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)（cfu/ml） 實驗次數(shù)金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉大腸埃希菌123表3稀釋劑對照組的菌回收率培養(yǎng)基稀釋法（1ml加2個平皿）實驗次數(shù)人工染菌回收

8、率%金葡菌枯草桿菌白色念珠菌黑曲霉大腸埃希菌123表4試驗組的平均菌落數(shù)（cfu/ml） 實驗次數(shù)金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉大腸埃希菌123表5供試品對照組的平均菌落數(shù)（cfu/ml） 實驗次數(shù)金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉大腸埃希菌123表6試驗組的菌回收率 實驗次數(shù)人工染菌回收率%金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉大腸埃希菌1233.5.8結(jié)論檢查人： 日期：3.5控制菌檢查方法的驗證3.5.1 驗證試驗用菌種：驗證試驗用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗菌株的生物學(xué)特性。a.大腸

9、埃希菌(Escherichia coli)CMCC(B) 44 102 b.金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CMCC(B) 26 003c.乙型副傷寒沙門菌（Salmonella paratyphi-B）CMCC(B) 50 094d.銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CMCC(B) 10 104e.生孢梭菌(Clostridium sporogenes) CMCC(B)64 9413.5.2菌液制備：分別取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少許，各接種至5ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，置361培養(yǎng)182

10、4h，取均勻培養(yǎng)物1ml用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成每1ml含菌10100cfu的菌懸液，其菌數(shù)在做對照試驗的同時用營養(yǎng)瓊脂注皿或平板涂布，經(jīng)培養(yǎng)后計數(shù)確定。生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時。用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為10100cfu的菌懸液。3.5.3 供試液制備 同“計數(shù)方法驗證”供試液制備。3.5.4驗證方法3.5.4.1試驗組：取規(guī)定量供試液及10100cfu試驗菌加入增菌培養(yǎng)中，依相應(yīng)控制菌檢查法進(jìn)行檢查。（當(dāng)采用薄膜過濾法時，取規(guī)定量供試液，過濾，沖洗，試驗菌應(yīng)加在最后一次沖洗液中，過濾后，注入增菌培養(yǎng)基或取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中）3.5.4.2陰性菌對照組設(shè)立陰性菌對照組是為了驗證該控制菌檢查方法的專屬性。方法同試驗組，驗證大腸埃希菌、大腸菌群檢查法時的陰性對照菌采用金黃色葡萄球菌；驗證銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌，梭菌檢查法時的陰性對照菌采用大腸埃希菌。陰性對照菌不得檢出。3.5.5結(jié)果判定陰性對照組不檢出陰性對照菌。若試驗組檢出試驗菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法作該供試品的控制菌檢查；若試驗組未檢出試驗菌，應(yīng)參照“細(xì)菌