抗球蛋白試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

1、抗球蛋白試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程1.檢驗(yàn)?zāi)康谋ＷC抗球蛋白試驗(yàn)符合要求。2.檢驗(yàn)方法 本試驗(yàn)包括“直接抗球蛋白”和“間接抗球蛋白”試驗(yàn)。2.1直接抗球蛋白試驗(yàn)2.1.1 原理患者體內(nèi)若有與紅細(xì)胞抗原不相合的不完全抗體存在，可與紅細(xì)胞結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物。但因不完全抗體分子量小，不能有效地連接紅細(xì)胞，僅使紅細(xì)胞處于致敏狀態(tài)。加入抗球蛋白血清，與紅細(xì)胞上吸附的不完全抗體結(jié)合，在致敏紅細(xì)胞之間搭橋，出現(xiàn)肉眼可見的凝集。這種直接檢測(cè)體內(nèi)被抗體或(和)補(bǔ)體致敏紅細(xì)胞的試驗(yàn)稱之為直接抗球蛋白試驗(yàn)。直接抗球蛋白試驗(yàn)主要用于檢查受檢紅細(xì)胞是否在體內(nèi)已被抗體或者補(bǔ)體致敏，用于新生兒溶血病，溶血性輸血反應(yīng)，自身免疫溶血性

2、貧血，藥物誘導(dǎo)溶血性貧血等檢查。2.1.2.標(biāo)本EDTA抗凝的靜脈血2.0ml。 2.1.3.試劑多特異性抗球蛋白試劑、抗IgG、抗C3d；2.1.4.器材 離心機(jī)、小試管、刻度吸管或加樣器（50200l）、37水浴箱等。2.1.5.操作步驟2.1.5.1.取3支試管分別加入多特異性抗球蛋白試劑、抗IgG、抗C3d試劑各1滴，然后再加1滴受檢者三洗后的2-3%紅細(xì)胞懸液，混勻。2.1.5.2. 各反應(yīng)管以3000r/min離心10秒，持一定的角度輕輕地?fù)u動(dòng)試管直到松動(dòng)所有細(xì)胞。先用肉眼觀察管底紅細(xì)胞的凝集，再用低倍鏡觀察。2.1.5.3.對(duì)照：用IgG致敏細(xì)胞（抗D血清加Rh陽性細(xì)胞，37水浴

3、30分鐘，洗3次配成3%紅細(xì)胞鹽水懸液）作為多抗及單抗IgG的陽性對(duì)照，陰性對(duì)照用正常人AB型血清與正常人“O”型紅細(xì)胞反應(yīng)。2.1.6.結(jié)果判斷先觀察陰性和陽性對(duì)照管，陰性對(duì)照管無凝集，陽性對(duì)照管出現(xiàn)凝集，說明檢測(cè)管結(jié)果可信。如被檢測(cè)管凝集，直接抗球蛋白試驗(yàn)陽性，不凝集者為陰性。如實(shí)驗(yàn)結(jié)果陰性要加試劑對(duì)照細(xì)胞檢查，對(duì)照陰性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。2.1.7注意事項(xiàng)2.1.7.1.標(biāo)本采取后應(yīng)立即進(jìn)行試驗(yàn)，延遲試驗(yàn)或中途停止可使抗體從細(xì)胞中丟失。2.1.7.2.抗球蛋白試劑應(yīng)按說明書最適稀釋度使用，否則可產(chǎn)生前帶或后帶現(xiàn)象而誤認(rèn)為陰性結(jié)果。2.1.7.3.受檢紅細(xì)胞一定要用鹽水洗滌3次，除去紅細(xì)胞懸液中

4、混雜的血清蛋白，以防止假陰性結(jié)果。2.1.7.4.最好對(duì)陰性結(jié)果進(jìn)行核實(shí)，即在該試管中再加1滴IgG致敏紅細(xì)胞，如結(jié)果為陽性，則表示試管內(nèi)的抗球蛋白試劑未被消耗，陰性結(jié)果可靠。2.1.7.5.紅細(xì)胞上吸附抗體太少或Coombs試驗(yàn)陰性的自身免疫性溶血性貧血患者，直接抗球蛋白試驗(yàn)可呈假陰性反應(yīng)。2.2.間接抗球蛋白試驗(yàn)2.2.1. 原理用已知抗原的紅細(xì)胞檢測(cè)受檢者血清中相應(yīng)的不完全抗體；或用已知的不完全抗體檢測(cè)受檢者紅細(xì)胞上相應(yīng)的抗原。在37條件下孵育，若被檢血清或紅細(xì)胞有對(duì)應(yīng)的不完全抗體或抗原，抗原抗體作用使紅細(xì)胞致敏，再加入抗球蛋白試劑，與紅細(xì)胞上不完全抗體結(jié)合，出現(xiàn)肉眼可見凝集。這種通過體

5、外將人血清致敏紅細(xì)胞后，再檢測(cè)紅細(xì)胞上有無不完全抗體或補(bǔ)體吸附的試驗(yàn)稱為間接抗球蛋白試驗(yàn)（indirect anti-globulin test，IAT）。主要用于檢測(cè)受檢者血清中游離的不規(guī)則抗體，可應(yīng)用于抗體篩查，抗體鑒定，血型抗原鑒定及交叉配血實(shí)驗(yàn)等。2.2.2.標(biāo)本EDTA抗凝的靜脈血2.0ml。2.2.3.試劑多特異性抗球蛋白試劑、IgG、C3d；已知抗體血清（用于檢測(cè)特殊紅細(xì)胞抗原）；5已知抗原的紅細(xì)胞鹽水懸液（用于檢測(cè)血清中不完全抗體）；2-3 D陽性紅細(xì)胞鹽水懸液（陽性對(duì)照用）；不完全抗D血清；AB型血清。2.2.4.器材 離心機(jī)、小試管、刻度吸管或加樣器（50200l）、37水

6、浴箱2.2.5操作步驟2.2.5.1.收到標(biāo)本和檢測(cè)申請(qǐng)單 , 先核對(duì)標(biāo)本的試管編號(hào)或 / 和姓名與申請(qǐng)單上內(nèi)容是否相符。 做好標(biāo)本接收記錄。2.2.5.2.取小試管 4 只 , 標(biāo)記并分別加入待檢血漿 2 滴。2.2.5.3. 以上 4 管中分別加入抗體篩選細(xì)胞、以及自身紅細(xì)胞懸液各 1 滴 , 混勻。 2.2.5.4.另取小試管1只做陽性對(duì)照：加入3%D陽性細(xì)胞，再加入IgG抗D血清2滴。2.2.5.5.另取小試管1只做陰性對(duì)照：加入3%D陽性細(xì)胞，再加入AB型血清2滴。2.2.5.6.各反應(yīng)管混勻，置 37 水浴箱孵育 30 分鐘 。2.2.5.7. 將各管中紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌三次 ,

7、 末次離心后必須盡量棄去上清液（在吸水紙上扣干）。 2.2.5.8.各管加多特異性抗球蛋白試劑各 l滴 , 混勻 , 以3000r/min離心10秒, 肉眼判斷紅細(xì)胞凝集情況。2.2.6.結(jié)果判定2.2.6.1. 抗體篩選細(xì)胞、號(hào) 3 管中任一管出現(xiàn)凝集 , 并且“自身對(duì)照”管中無凝集現(xiàn) 象自則表明間抗試驗(yàn)陽性。2.2.6.2. 抗體篩選細(xì)胞、號(hào) 3 管均不凝集 , 則表明間抗試驗(yàn)陰性。2.2.7.注意事項(xiàng)2.2.7.1.紅細(xì)胞洗滌應(yīng)迅速、徹底。要將生理鹽水用力沖入管底，使管底紅細(xì)胞松散分離。要防止手上的蛋白質(zhì)污染。1滴14000稀釋的血清可中和抗球蛋白血清1滴，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。2.2.7.2.離心速度和時(shí)間非常重要，應(yīng)取能使陽性對(duì)照管出現(xiàn)陽性反應(yīng)的最小離心力和最短離心時(shí)間。2.2.7.3. 當(dāng)紅細(xì)胞上抗體數(shù)量較少，可通過反復(fù)離心、搖動(dòng)，再離心的方法，增加抗原抗體的接觸，提高陽性率。2.2.7.5.如果檢測(cè)的抗體為補(bǔ)體依賴抗體，則必須加入新鮮AB型血清，抗球蛋白血清中也應(yīng)含有抗C3。2.2.8.紅細(xì)胞洗滌本方法適合于少量紅細(xì)胞的試管法洗滌 , 紅細(xì)胞的量不超過 5 滴 25% 紅細(xì)胞懸液中含有的紅細(xì)胞。2.2.8.1.搖動(dòng)試管 , 使試管中不存在貼壁的紅細(xì)胞。2.2.8.2.向試管中加入鹽水 , 約至試管總?cè)萘?2/3 處。