dna測序儀【精制材料】

1、第十四章 全自動(dòng)DNA測序儀和 蛋白質(zhì)自動(dòng)測序儀,1,實(shí)操應(yīng)用,元素周期表的發(fā)現(xiàn)奠定了二十世紀(jì)物理、化學(xué)研究和發(fā)展的基礎(chǔ),元素周期表,“基因組序列圖”將奠定二十一世紀(jì)生命科學(xué)研究和生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)！,“基因組”-生命科學(xué)的“元素周期表”,人體解剖圖奠定了現(xiàn),代醫(yī)學(xué)發(fā)展的基礎(chǔ),2,實(shí)操應(yīng)用,生命的奧秘蘊(yùn)藏于 “四字天書”之中,GCTTCTTCCTCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCCGCCACCA TCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCTTCTTCCTCATTTTCTCT CCACCATGCCGCCACCACGCCACCATGCTTCTTCCTCATCTC GCTTTC

2、TTGCCGCCACCATGCCGCCACCGCTTCTTCCtTCTCT,3,實(shí)操應(yīng)用,了解生命現(xiàn)象、解釋疾病的發(fā)生、診斷和治療疾病，是生命科學(xué)的核心內(nèi)容之一 核酸和蛋白質(zhì)是控制生命過程的兩種重要大分子，其結(jié)構(gòu)或功能異常是導(dǎo)致遺傳性疾病或遺傳相關(guān)性疾病的主要因素或相關(guān)因素，是生命科學(xué)研究的主要對(duì)象,4,實(shí)操應(yīng)用,核酸分子攜帶生命活動(dòng)的全套信息，其基本結(jié)構(gòu)核苷酸的線性排列構(gòu)成它的一級(jí)結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)是指構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位氨基酸的排列順序，研究蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)是了解蛋白質(zhì)功能的基礎(chǔ),5,實(shí)操應(yīng)用,第一節(jié) 全自動(dòng)DNA測序儀,DNA測序 核苷酸序列 早期：小片段重疊法 通過測定RNA序列來

3、推測DNA序列 缺點(diǎn)：既費(fèi)時(shí)又不準(zhǔn)確 20世紀(jì)80年代以后 ：DNA自動(dòng)測序儀 Sanger雙脫氧鏈末端終止法 Maxam-Gilber化學(xué)降解法 優(yōu)點(diǎn)：操作簡單、安全、快速、準(zhǔn)確,6,實(shí)操應(yīng)用,Sanger雙脫氧鏈末端終止法 Maxam-Gilber化學(xué)降解法 都是根據(jù)在某一固定的點(diǎn)開始核苷酸鏈的延伸，隨機(jī)在某一個(gè)特定的堿基處終止，產(chǎn)生A、T、C、G四組不同長度的一系列核苷酸鏈，在變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳進(jìn)行片段的分離和檢測，從而獲得DNA序列 雙脫氧鏈末端終止法更簡便和更適合于光學(xué)自動(dòng)探測，故在全自動(dòng)DNA測序儀中應(yīng)用廣泛,7,實(shí)操應(yīng)用,原理 一個(gè)末端標(biāo)記的DNA片段在4組互相獨(dú)立的化學(xué)反

4、應(yīng)中分別得到部分降解，其中每一組反應(yīng)特異的針對(duì)某一種或某一類堿基。因此生成4種放射性標(biāo)記的分子，從共同起點(diǎn)（放射性標(biāo)記末端）延續(xù)到發(fā)生化學(xué)降解的位點(diǎn)。每組混合物中均含有長短不一的DNA分子，其長度取決于該組反應(yīng)所針對(duì)的堿基在原DNA全片段上位置。此后，各組均通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，再通過放射自顯影來檢測末端標(biāo)記的分子。,Maxam-Gilber化學(xué)降解法,8,實(shí)操應(yīng)用,基本步驟 第一步，對(duì)特定堿基（或特定類型的堿基）進(jìn)行化學(xué)修飾； 第二步，修飾堿基從糖環(huán)上脫落，修飾堿基5和3的磷酸二酯鍵斷裂； 第三步，比較G、A+G、C+T、C以及AC各個(gè)泳道，可從測序凝膠的放射自顯影片上讀取DNA序

5、列。,9,實(shí)操應(yīng)用,10,實(shí)操應(yīng)用,特點(diǎn),重現(xiàn)性好，所用試劑簡單，易于掌握； 所測長度比Sanger法短一些，對(duì)放射性標(biāo)記末端250個(gè)核苷酸以內(nèi)的DNA序列效果較好； 序列來自原DNA分子而不是酶促合成反應(yīng)所生成的拷貝； 可對(duì)合成的寡核苷酸進(jìn)行測序，用以分析諸如甲基化等DNA修飾的情況，通過化學(xué)保護(hù)及修飾干擾實(shí)驗(yàn)來研究DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)-DNA相互作用。 無需延伸反應(yīng)及克隆 更適于含有稀有堿基或GC含量高及短鏈寡核苷酸的測序，可雙向標(biāo)記并測序。 比較繁瑣費(fèi)時(shí)，過長序列有困難。,11,實(shí)操應(yīng)用,12,實(shí)操應(yīng)用,13,實(shí)操應(yīng)用,14,實(shí)操應(yīng)用,（一）雙脫氧鏈末端終止法測序原理,利用DNA的體

6、外合成過程聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction, PCR） DNA聚合酶的催化 以目的DNA為模板 按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則 在引物的引導(dǎo)下,單核苷酸聚合形成新DNA鏈,15,實(shí)操應(yīng)用,普通的PCR反應(yīng)體系中，加入的核苷酸單體為 4種2-脫氧核苷三磷酸（dATP，dCTP，dGTP，dTTP）,dNTP結(jié)構(gòu)示意圖,16,實(shí)操應(yīng)用,測序反應(yīng)體系中，加入的核苷酸單體為 2,3-雙脫氧核苷三磷酸 （ddNTP）,ddNTP結(jié)構(gòu)示意圖,17,實(shí)操應(yīng)用,PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）原理,反應(yīng)所需物質(zhì)：DNA模板、引物、DNA聚合 酶、dNTP、緩沖液 每個(gè)循環(huán)包括：變性（90）、退火

7、（54 ）、延伸（72 ）,18,實(shí)操應(yīng)用,與dNTP相比，ddNTP在脫氧核糖的位置上缺少一個(gè)羥基，反應(yīng)過程中雖然可以在DNA聚合酶作用下，通過其磷酸基團(tuán)與正在延伸的DNA鏈的末端脫氧核糖-OH發(fā)生反應(yīng)，形成磷酸二酯鍵而摻入到DNA鏈中，但它們本身沒有-OH，不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵，從而使正在延伸的DNA鏈在此終止。,19,實(shí)操應(yīng)用,據(jù)此原理分別設(shè)計(jì)四個(gè)反應(yīng)體系，每一反應(yīng)體系中存在相同的DNA模板、引物、四種dNTP和一種ddNTP(如ddATP)，則新合成的DNA鏈在可能摻入正常dNTP的位置都有可能摻入ddNTP而導(dǎo)致新合成鏈在不同的位置終止。 由于存在ddNTP與dNTP的

8、競爭，生成的反應(yīng)產(chǎn)物是一系列長度不同的多核苷酸片段。,20,實(shí)操應(yīng)用,dNTPs,雙脫氧鏈末端終止法測序反應(yīng)原理（1）,21,實(shí)操應(yīng)用,雙脫氧鏈末端終止法測序反應(yīng)原理（2）,22,實(shí)操應(yīng)用,雙脫氧鏈末端終止法測序反應(yīng)原理（3）,23,實(shí)操應(yīng)用,雙脫氧鏈末端終止法測序反應(yīng)原理（4）,24,實(shí)操應(yīng)用,25,實(shí)操應(yīng)用,雙脫氧鏈末端終止法測序反應(yīng)原理（5）,26,實(shí)操應(yīng)用,（二）新生鏈的熒光標(biāo)記原理,早期采用同位素法標(biāo)記新生鏈，因其具有放射性危害、背景高等缺點(diǎn)而很快被熒光染料標(biāo)記法所取代 熒光染料的熒光和散射背景較弱，提高了信噪比；它們的激發(fā)光譜較接近而發(fā)射光譜均位于可見光范圍，且不同染料的發(fā)射光譜相

9、互分開，易于監(jiān)測，故在DNA自動(dòng)測序中得到廣泛應(yīng)用,27,實(shí)操應(yīng)用,熒光染料 標(biāo)記法,單色熒光標(biāo)記法 多色熒光標(biāo)記法,熒光標(biāo)記引物法 熒光標(biāo)記終止底物法,熒光標(biāo)記引物法 熒光標(biāo)記終止底物法,28,實(shí)操應(yīng)用,多色熒光標(biāo)記法 - 熒光標(biāo)記引物法 定義：將熒光染料預(yù)先標(biāo)記在測序反應(yīng)所用引物的5端 一組（4種）熒光標(biāo)記引物，其序列相同，但標(biāo)記的熒光染料顏色不同 測序反應(yīng)中，模板、反應(yīng)底物、DNA聚合酶及標(biāo)記引物等按A、T、C、G編號(hào)被置于4支微量離心管中，A、T、C、G四個(gè)測序反應(yīng)分管進(jìn)行，上樣時(shí)合并在一個(gè)泳道內(nèi)電泳。特定顏色熒光標(biāo)記的引物則與特定的雙脫氧核苷酸底物保持對(duì)應(yīng)關(guān)系,29,實(shí)操應(yīng)用,熒光標(biāo)

10、記引物法,圖18-8 熒光標(biāo)記引物法原理,30,實(shí)操應(yīng)用,多色熒光標(biāo)記法 - 熒光標(biāo)記終止底物法 定義：將熒光染料標(biāo)記在作為終止底物的雙脫氧單核苷酸上 反應(yīng)中將4種ddNTP分別用4種不同的熒光染料標(biāo)記，帶有熒光基團(tuán)的ddNTP在摻入DNA片段導(dǎo)致鏈延伸終止的同時(shí)，也使該片段端標(biāo)上了一種特定的熒光染料 經(jīng)電泳后將各個(gè)熒光譜帶分開，根據(jù)熒光顏色的不同來判斷所代表的不同堿基信息,31,實(shí)操應(yīng)用,模板：T C C A T G A T 產(chǎn)物：A A G A G G A G G T A G G T A A G G T A C A G G T A C T,新生鏈的熒光標(biāo)記原理,32,實(shí)操應(yīng)用,都確定了4種

11、熒光染料與4種ddNTP所終止的DNA片段之間的專一對(duì)應(yīng)關(guān)系 熒光標(biāo)記引物法使熒光有色基團(tuán)標(biāo)記在長短不同的DNA片段的端，可理解為熒光染料標(biāo)記過程和延伸反應(yīng)終止分別發(fā)生在同一DNA片段的兩端，且標(biāo)記發(fā)生在引物與模板的退火過程中，而終止是發(fā)生在片段延伸過程中，兩者在時(shí)間上有一定間隔 熒光標(biāo)記終止底物法使標(biāo)記和終止過程合二為一，兩者在同一時(shí)間完成 在具體操作中，前者要求A、C、G、T四個(gè)反應(yīng)分別進(jìn)行，而后者的四種反應(yīng)可以在同一管中完成,熒光標(biāo)記引物法和熒光標(biāo)記終止底物法的異同點(diǎn)：,33,實(shí)操應(yīng)用,單色熒光標(biāo)記法 也包括熒光標(biāo)記引物法和熒光標(biāo)記終止底物法 與多色熒光標(biāo)記法不同的是單色熒光標(biāo)記引物法和

12、熒光標(biāo)記終止底物法均需將A、C、G、T四個(gè)反應(yīng)分別在不同擴(kuò)增管中進(jìn)行，電泳時(shí)各管產(chǎn)物也分別在不同泳道中電泳,34,實(shí)操應(yīng)用,均可分為熒光標(biāo)記引物法和熒光標(biāo)記終止底物法 單色熒光標(biāo)記法需將A、C、G、T四個(gè)反應(yīng)分別在不同擴(kuò)增管中進(jìn)行，電泳時(shí)各管產(chǎn)物也分別在不同泳道中電泳 多色熒光標(biāo)記引物法需將A、C、G、T四個(gè)反應(yīng)分別在不同擴(kuò)增管中進(jìn)行，電泳時(shí)可合并在同一泳道中電泳 多色熒光標(biāo)記終止底物法可將A、C、G、T四個(gè)反應(yīng)在同一擴(kuò)增管中進(jìn)行，電泳時(shí)在同一泳道中電泳,單色熒光標(biāo)記法與多色熒光標(biāo)記法的異同點(diǎn)：,35,實(shí)操應(yīng)用,（三）熒光標(biāo)記DNA的檢測原理,測序反應(yīng)一般以單引物進(jìn)行DNA聚合酶延伸反應(yīng)，絕大

13、多數(shù)產(chǎn)物均為單鏈 反應(yīng)結(jié)束后，樣品經(jīng)簡單純化處理就可以放置到自動(dòng)測序儀中開始電泳 兩極間極高的電勢差推動(dòng)著各個(gè)熒光DNA片段在凝膠高分子聚合物中從負(fù)極向正級(jí)泳動(dòng)并達(dá)到相互分離，且依次通過檢測窗口 由激光器發(fā)出的極細(xì)光束，通過精密的光學(xué)系統(tǒng)被導(dǎo)向檢測區(qū)，在這里激光束以與凝膠垂直的角度激發(fā)熒光DNA片段,36,實(shí)操應(yīng)用,DNA片段上的熒光發(fā)色基團(tuán)吸收了激光束提供的能量而發(fā)射出特征波長的熒光 代表不同堿基信息的不同顏色熒光經(jīng)過光柵分光后再投射到CCD攝像機(jī)上同步成像。收集的熒光信號(hào)再傳輸給計(jì)算機(jī)加以處理 整個(gè)電泳過程結(jié)束時(shí)在檢測區(qū)某一點(diǎn)上采集的所有熒光信號(hào)就轉(zhuǎn)化為一個(gè)以時(shí)間為橫軸坐標(biāo)，熒光波長種類和

14、強(qiáng)度為縱軸的信號(hào)數(shù)據(jù)的集合 經(jīng)測序分析軟件對(duì)這些原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，最后的測序結(jié)果以一種清晰直觀的圖形顯示出來,37,實(shí)操應(yīng)用,多色熒光標(biāo)記技術(shù)檢測優(yōu)點(diǎn)： 一個(gè)樣本的四個(gè)測序反應(yīng)產(chǎn)物可以同時(shí)在一個(gè)泳道內(nèi)電泳，避免單一標(biāo)記時(shí)四個(gè)泳道測序因泳道間遷移率不同對(duì)精確度的影響，提高了測序精度 一個(gè)樣品所有反應(yīng)產(chǎn)物只需進(jìn)樣一次，所以一次實(shí)驗(yàn)便可以處理較之手工方法更多的樣品。在相同樣品數(shù)的情況下，加樣的工作量也大大減少,38,實(shí)操應(yīng)用,DNA序列測定的策略,克隆亞克隆的方法 (clone-by-clone) 全基因組散彈法(鳥槍法) (whole-genome shotgun method),39,實(shí)操應(yīng)用,

15、兩種大規(guī)模基因組測序策略的比較,40,實(shí)操應(yīng)用,克隆亞克隆的方法 (clone-by-clone),是以物理圖譜為基礎(chǔ)、以大插入片斷克隆為單位的定向測序策略。其方法是先構(gòu)建議染色體為單位的遺傳圖譜，再利用高覆蓋率的大片斷基因組文庫（BAC、YAC等）獲得精細(xì)的物理圖譜，選擇合適的BAC或YAC克隆進(jìn)行亞克隆測序，用計(jì)算機(jī)拼裝，通過引物步移等手段填補(bǔ)BAC內(nèi)的空洞，形成一條完整的BAC序列。然后參照物理圖譜，將相互關(guān)聯(lián)、部分重疊的BAC克隆聯(lián)成一個(gè)大的重疊群(Contig)。但一些長串聯(lián)的高度重復(fù)序列區(qū)域和克隆或測序所不能獲得的區(qū)域，仍會(huì)存在一些物理空洞（Physical Gap）。與Shot-

16、gun方法相比較，Clone by Clone的技術(shù)難度較高，尤其是大片段基因組文庫（如BAC文庫）的精細(xì)物理圖譜的構(gòu)建是技術(shù)性極強(qiáng)的工作；并且測序費(fèi)用和所需的時(shí)間也相對(duì)較多。,41,實(shí)操應(yīng)用,人類基因組計(jì)劃研究的主要成果和進(jìn)展表現(xiàn)在這“四張圖”,遺傳圖譜 又稱為連鎖圖譜（linkage map），指基因或DNA標(biāo)志在染色體上的相對(duì)位置與遺傳距離 物理圖譜 以定位的DNA標(biāo)記序列如STS作為路標(biāo)，以DNA實(shí)際長度即bp、kb、Mb為圖距的基因組圖譜。 轉(zhuǎn)錄圖譜 利用EST（expressed sequence tags 表達(dá)序列標(biāo)簽）作為標(biāo)記所構(gòu)建的分子遺傳圖譜 序列圖譜 通過基因組測序得到的

17、，以A、T、G、C為標(biāo)記單位的基因組DNA序列,42,實(shí)操應(yīng)用,43,實(shí)操應(yīng)用,全基因組散彈法(鳥槍法)(whole-genome shotgun method),是借助物理和化學(xué)的手段，將整個(gè)基因隨機(jī)打斷成一定大小的片段進(jìn)行測序，再根據(jù)序列間的重疊關(guān)系進(jìn)行計(jì)算機(jī)拼接和組裝，確定它們?cè)诨蚪M中的位置。Shot-gun的優(yōu)點(diǎn)是速度快、簡單易行、成本較低，可在短時(shí)間內(nèi)通過集中設(shè)備和人力獲得海量的基因組序列。缺點(diǎn)在于序列的拼接組裝比較困難，在重復(fù)序列較多的區(qū)域難度更大；由于缺少基因組的物理圖譜，有些序列難以準(zhǔn)確定位，成為游離片段；此外，受文庫的隨機(jī)性和測序的覆蓋度的影響，某些區(qū)域會(huì)形成較大的空洞（G

18、ap）,44,實(shí)操應(yīng)用,45,實(shí)操應(yīng)用,二、全自動(dòng)DNA測序儀的結(jié)構(gòu)與功能,全自動(dòng)DNA測序儀 平板型電泳的凝膠灌制在兩塊玻璃板中間，聚合后厚度一般小于0.4mm或更少，因此又稱為超薄片層凝膠電泳 毛細(xì)管電泳技術(shù)將凝膠高分子聚合物灌制于毛細(xì)管中（內(nèi)徑50m100m），在高壓及較低濃度膠的條件下實(shí)現(xiàn)DNA片段的快速分離,平板型電泳 毛細(xì)管電泳,46,實(shí)操應(yīng)用,310型全自動(dòng)遺傳分析儀,ABI Prism 3100遺傳分析儀,3700型全自動(dòng)遺傳分析儀,安瑪西亞DNA序列分析系統(tǒng)型號(hào)：MegaBACE 500/1000/4000,47,實(shí)操應(yīng)用,（一）儀器的組成,主機(jī)： 主要包括電泳系統(tǒng)、激光器和

19、熒光檢測系統(tǒng) ；大致可分為自動(dòng)進(jìn)樣器區(qū) 、凝膠塊區(qū)和檢測區(qū)等結(jié)構(gòu)功能區(qū) 微型計(jì)算機(jī) 各種應(yīng)用軟件,48,實(shí)操應(yīng)用,PE310 基因分析儀的結(jié)構(gòu),49,實(shí)操應(yīng)用,凝膠塊區(qū),自動(dòng)進(jìn)樣器區(qū),檢測區(qū),PE310 基因分析儀的主機(jī)分區(qū),50,實(shí)操應(yīng)用,熱板,毛細(xì)管,雷射檢測器,注射器驅(qū)動(dòng)桿,毛細(xì)管和電極,注射器,正極緩沖液,泵塊,自動(dòng)進(jìn)樣器,負(fù)極緩沖液,PE310 基因分析儀的基本結(jié)構(gòu),51,實(shí)操應(yīng)用,（二）儀器各組成部分的功能,1. 主機(jī)功能 具有自動(dòng)灌膠、進(jìn)樣、電泳、熒光檢測等功能 (1)自動(dòng)進(jìn)樣器區(qū)功能 自動(dòng)進(jìn)樣器受程序控制進(jìn)行三維移動(dòng)，因負(fù)極電極和毛細(xì)管均固定不動(dòng)，故許多操作如毛細(xì)管進(jìn)入樣品盤標(biāo)

20、本孔中進(jìn)樣、電極和毛細(xì)管在電極緩沖液瓶、洗滌液和廢液管中移動(dòng)等均依靠自動(dòng)進(jìn)樣器的移動(dòng)完成；,52,實(shí)操應(yīng)用,電極為電泳的負(fù)性電極，測序過程中，正、負(fù)極之間的電勢差可達(dá)15000伏，如此高的電勢差可促進(jìn)DNA分子在毛細(xì)管中很快泳動(dòng)，達(dá)到快速分離不同長度DNA片段的目的； 樣品盤有48孔和96孔兩種，可一次性連續(xù)測試48或96個(gè)樣本 電極固定螺母起固定電極及毛細(xì)管的作用。,53,實(shí)操應(yīng)用,(2)凝膠塊區(qū)功能 注射器驅(qū)動(dòng)桿：給注射器提供正壓力，將注射器內(nèi)的凝膠注入毛細(xì)管中。在分析每一個(gè)樣品前，泵自動(dòng)沖掉上一次分析用過的膠，灌入新膠； 樣品盤按鈕：控制自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)出； 注射器固定平臺(tái)：起固定注射器的作

21、用； 電極：為電泳的正性電極，始終浸泡在正極緩沖液中；,54,實(shí)操應(yīng)用,正極緩沖液閥：當(dāng)注射器驅(qū)動(dòng)桿下移，將注射器內(nèi)的凝膠壓入毛細(xì)管時(shí)，緩沖液閥關(guān)閉，以防止膠進(jìn)入緩沖液；電泳時(shí)此閥打開，提供電流通道； 玻璃注射器：儲(chǔ)存凝膠高分子聚合物以及在填充毛細(xì)管時(shí)提供必要的壓力； 毛細(xì)管固定螺母：固定毛細(xì)管； 廢液閥：在清洗泵塊時(shí)控制廢液流。,55,實(shí)操應(yīng)用,(3)檢測區(qū)功能 激光檢測器窗口及窗蓋： 激光檢測器窗口正對(duì)毛細(xì)管檢測窗口，從儀器內(nèi)部的氬離子激光器發(fā)出的激光可通過激光檢測器窗口照到毛細(xì)管檢測窗口上。電泳時(shí)，當(dāng)熒光標(biāo)記DNA鏈上的熒光基團(tuán)通過毛細(xì)管窗口時(shí)，受到激光的激發(fā)而產(chǎn)生特征性的熒光光譜，熒光

22、經(jīng)分光光柵分光后投射到CCD攝像機(jī)上同步成像。 窗蓋起固定毛細(xì)管的作用，同時(shí)可防止激光外泄；,56,實(shí)操應(yīng)用,激光檢測器檢測特征性的熒光光譜,激光檢測器檢測特征性的熒光光譜,57,實(shí)操應(yīng)用,加熱板：電泳過程中起加熱毛細(xì)管的作用，一般維持在50； 毛細(xì)管：為填充有凝膠高分子聚合物的玻璃管，直徑為50m，電泳時(shí)樣品在毛細(xì)管內(nèi)從負(fù)極向正極泳動(dòng)； 熱敏膠帶：將毛細(xì)管固定在加熱板上。,58,實(shí)操應(yīng)用,DNA測序圖,59,實(shí)操應(yīng)用,2. 微型計(jì)算機(jī)功能 控制主機(jī)的運(yùn)行，并對(duì)來自主機(jī)的數(shù)據(jù)進(jìn)行收集和分析。設(shè)置測序條件（樣品的進(jìn)樣量、電泳的溫度、時(shí)間、電壓等），同步監(jiān)測電泳情況并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析 3.各類軟件功能

23、 承擔(dān)數(shù)據(jù)收集、DNA序列分析及DNA片段大小和定量分析等功能。其結(jié)果可由彩色打印機(jī)輸出,60,實(shí)操應(yīng)用,三、全自動(dòng)DNA測序儀的常見 故障及維護(hù),毛細(xì)管電泳型DNA測序儀 平板電泳型DNA測序儀,電泳時(shí)儀器顯示無電流 電極彎曲 電泳時(shí)產(chǎn)生電弧 其它,電泳時(shí)儀器顯示無電流 傳熱板粘住膠板 其它,61,實(shí)操應(yīng)用,（一）毛細(xì)管電泳型DNA測序儀的常見故障及維護(hù),電泳時(shí)儀器顯示無電流 電泳緩沖液蒸發(fā)使液面降低，而未能接觸到毛細(xì)管 電極彎曲而無法浸入緩沖液中 毛細(xì)管未浸入緩沖液中 毛細(xì)管內(nèi)有氣泡等,62,實(shí)操應(yīng)用,電極彎曲 安裝、調(diào)整或清洗電極后未進(jìn)行電極定標(biāo)操作就直接執(zhí)行電泳命令，電極不能準(zhǔn)確插入各

24、管中 運(yùn)行前未將樣品盤歸位、或雖然執(zhí)行了歸位操作，但X/Y軸歸位尚未結(jié)束就運(yùn)行Z軸歸位等,63,實(shí)操應(yīng)用,電泳時(shí)產(chǎn)生電弧 主要原因是電極、加熱板或自動(dòng)進(jìn)樣器上有灰塵沉積 其它 測序結(jié)束后應(yīng)將毛細(xì)管負(fù)極端浸在蒸餾水中，避免凝膠干燥而阻塞毛細(xì)管 定期清洗泵塊 定期更換電極緩沖液、洗滌液和廢液管,64,實(shí)操應(yīng)用,（二）平板電泳型DNA測序儀的常見故障及維護(hù),電泳時(shí)儀器顯示無電流 電泳緩沖液配制不正確 電極導(dǎo)線未接好或損壞 正極或負(fù)極鉑金絲斷裂 正極或負(fù)極的膠面未浸入緩沖液中 傳熱板粘住膠板 主要原因?yàn)樯戏降木彌_液室漏液,65,實(shí)操應(yīng)用,其它 倒膠前應(yīng)按照操作要求認(rèn)真清洗玻璃板 配制凝膠時(shí)應(yīng)注意膠的濃

25、度、TEMED含量、尿素濃度等 倒膠時(shí)需注意不能有氣泡 將待測樣品加入各孔前，應(yīng)使用緩沖液沖洗各孔，把尿素沖去，以免影響電泳效果,66,實(shí)操應(yīng)用,Smith等于1986年首次建立了一種使用四種不同熒光分別標(biāo)記四種不同堿基的方法 同年，Ansorge建立了一種使用單色熒光四甲基羅丹明作為標(biāo)記染料的自動(dòng)測序方法 平板法電泳是經(jīng)典的電泳技術(shù)，具有樣品判讀序列長（600bp900bp）、一塊凝膠板上可同時(shí)進(jìn)行多個(gè)樣品測序（可達(dá)96個(gè)）的優(yōu)點(diǎn) 毛細(xì)管電泳為近20年來建立的一種快速、高效、進(jìn)樣量少、靈敏度高的新技術(shù)，可測序列達(dá)到750bp左右,67,實(shí)操應(yīng)用,四、全自動(dòng)DNA測序儀的進(jìn)展,單色熒光標(biāo)記 四

26、色熒光標(biāo)記 平板型電泳 毛細(xì)管電泳,芯片實(shí)驗(yàn)室（lab-on-a-chip） 縮微生物處理器（microfabricated bioprocessor），成功完成納升級(jí)標(biāo)本的Sanger DNA測序,68,實(shí)操應(yīng)用,縮微生物處理器結(jié)構(gòu)示意圖,2006年，美國科學(xué)院院報(bào)（PANS）上公布了Blazej等建立的縮微生物處理器測序技術(shù)?？s微生物處理器基本結(jié)構(gòu)為3層玻璃薄片和一層聚二甲基硅氧烷薄片，各層間緊密粘合形成圓盤狀，直徑僅10厘米。聚二甲基硅氧烷是一種新型材料，具有能調(diào)控水合作用、通透性好等特點(diǎn)，保證了縮微生物處理器能夠準(zhǔn)確進(jìn)行反應(yīng)。該材料最近在蛋白結(jié)晶結(jié)構(gòu)分析中也發(fā)揮了重要作用。,69,實(shí)操

27、應(yīng)用,五、全自動(dòng)DNA測序儀的主要應(yīng)用,人類基因組測序 人類遺傳病、傳染病和癌癥的基因診斷 法醫(yī)的親子鑒定和個(gè)體識(shí)別 生物工程藥物的篩選 動(dòng)植物雜交育種,70,實(shí)操應(yīng)用,第二節(jié) 蛋白質(zhì)自動(dòng)測序儀,蛋白質(zhì)順序指肽鏈中氨基酸的排列順序 通常從左至右表示肽鏈從氨基酸氨基端（N末端）到羧基端（C末端） 蛋白質(zhì)測序儀工作原理：執(zhí)行全自動(dòng)化的Edman化學(xué)降解反應(yīng)和游離氨基酸的分離與鑒定過程,71,實(shí)操應(yīng)用,一、蛋白質(zhì)測序儀的工作原理,Edman降解法,多肽鏈N末端NH2 PITC,弱堿,苯異硫甲氨酰肽,TFA,噻唑啉酮苯胺（ATZ）衍生物 剩余多肽,弱 堿,苯異硫甲氨酰肽,TFA,噻唑啉酮苯胺（ATZ）

28、衍生物 剩余多肽,PTH氨基酸,PTH氨基酸,HPLC,HPLC,苯異硫氰酸酯,三氟乙酸,經(jīng)酸作用，再進(jìn)一步環(huán)化,苯乙內(nèi)酰硫脲（PTH）衍生物,72,實(shí)操應(yīng)用,上述降解循環(huán)的偶聯(lián)和環(huán)化發(fā)生在測序儀的反應(yīng)器（筒）中，轉(zhuǎn)化則在轉(zhuǎn)化器進(jìn)行。 轉(zhuǎn)化后的PTH氨基酸經(jīng)自動(dòng)進(jìn)樣器注入高效液相色譜(high performance liquid chromatogram, HPLC)進(jìn)行在線檢測。 根據(jù)PTH氨基酸的洗滌滯流時(shí)間確定每一種氨基酸。,73,實(shí)操應(yīng)用,二、蛋白質(zhì)測序儀的結(jié)構(gòu)及其各部件的功能,測序反應(yīng)系統(tǒng) 主要部件為反應(yīng)器 氨基酸分析系統(tǒng) 由高效液相色譜毛細(xì)管層析柱組成 信息軟件處理系統(tǒng) 根據(jù)氨基酸的層析峰來判斷為何種氨基酸,74,實(shí)操應(yīng)用,三、蛋白質(zhì)測序儀的主要應(yīng)用,新蛋白質(zhì)的鑒定 在凝膠電泳中出現(xiàn)的未知條帶可以利用蛋白質(zhì)測序儀來測定其序列 分子克隆探針的設(shè)計(jì) 用蛋白質(zhì)序列信息設(shè)計(jì)PCR引物和寡核苷酸探針?？梢岳眠@些探針進(jìn)行cDNA文庫或基因組文庫的篩選 抗原的人工多肽合成,75,實(shí)操應(yīng)用,本 章 小 結(jié),DN