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文檔簡介

1、福林-酚法的原理 該方法是雙縮脲法的發(fā)展,包括兩步反應:(1)在堿性條件下,蛋白質與銅作用生成蛋白質銅絡合物。(2)此絡合物將試劑磷鉬酸磷鎢酸(FolIn試劑)還原,混合物深藍色(磷鉬藍和磷鎢藍混合物),顏色深淺與蛋白質含量成正比。此方法操作簡便,靈敏度比雙縮脲法高100倍,定量范圍為5100g蛋白質。FolIn試劑顯色反應由酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸引起,因此樣品中若含有酚類、檸檬酸和巰基化合物,均有干擾作用。此方法的缺點是有蛋白質的特異性影響,即不同蛋白質因絡氨酸、色氨酸含量的不同而使顯色強度稍有不同,標準曲線也不是嚴格的直線形式。【儀器與用具】試管若干;刻度移液管05Ml 1支,1Ml 1

2、支,10Ml 1支;定量加樣器;圓底燒瓶;冷凝管1套(帶橡膠管);微量滴定管;小燒杯;微量進樣器50l 1支;721分光光度計;恒溫水浴器;研缽;玻棒;離心機;離心管?!驹噭縉A2WO42H2O;NA2MoO42H2O;85H3PO4;濃HCl;LI2SO4H2O;溴水;酚酞指示劑;NA2CO3;NAOH;CuSO45H2O;酒石酸鉀鈉;牛血清白蛋白。所用試劑均為化學純或分析純?!痉椒ā?試劑的配制(1)堿性銅試劑(相當于雙縮脲試劑)的制備首先配制A液:4碳酸鈉(NA2CO3)溶液與0.2MolL氫氧化鈉(NAOH)溶液等比例混合(2NA2CO3,01Mol NAOH);B液:1硫酸銅(Cu

3、SO45H2O)溶液與2酒石酸鉀鈉溶液等比例混合(0.5CuSO45H2O,0.1酒石酸鉀鈉)。在使用前將A液與B液按501的比例混合即成。此為FolIn酚試劑甲液,此試劑只能使用1天。酚試劑(相當于FolIn試劑)的配備:稱取鎢酸鈉(NA2WO42H2O)100g、鉬酸鈉(NA2MoO42H2O)25g,加蒸餾水700Ml溶解于1500Ml的圓底燒瓶中。之后加入85的H3PO450Ml,濃HCl 100Ml,安上回流裝置(使用磨口接頭,若用軟木塞或橡皮塞時,就必須用錫鉑紙包起來),使其慢慢沸騰10H。冷卻后加入硫酸鋰(LI2SO4H2O)150g,水50Ml,溴水23滴,不用回流裝置開口煮沸

4、15Min,以釋放出過量的溴。待冷卻后稀釋至1000Ml,并過濾入棕色瓶中,密閉于冰箱中保存(冷卻后溶液呈黃色,倘若仍呈綠色,須再滴加數滴液體溴,繼續(xù)煮沸15Min)。使用時用標準NAOH溶液滴定,以酚酞作為指示劑,滴定終點由藍變灰,滴定后算出酸的濃度。使用時大約加水1倍,使最終濃度相當于1MolL H酸,此為FolIn酚試劑乙液(FolIn試劑)。在測定時要注意,因為酚試劑僅在酸性條件下穩(wěn)定,但此實驗的反應只在PH值為10的情況下發(fā)生,所以當加酚試劑時,必須立即混勻,以便在磷鉬酸磷鎢酸試劑被破壞前即能發(fā)生還原反應,否則會使顯色程度減弱。(2)標準蛋白質溶液的配制 稱取25mg牛血清白蛋白,溶

5、于100Ml蒸餾水中,使最終濃度為250gMl。2標準曲線的繪制(1)取7支試管,編號后,分別加入0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml標準蛋白質溶液,用蒸餾水補足1Ml,使每管含蛋白量分別為0g、25g、50g、100g、150g、200g、250g(必要時可做重復)。(2)在每支試管中用定量加樣器加入5Ml甲液,混勻,于30下放置10Min。(3)在每支試管中噴射加入0.5Ml乙液,立即振蕩混勻,在30下保溫30Min。(4)準確到30Min后,以不加標準蛋白試管中的溶液為空白,在500nM下用1CM光徑的比色杯對系列標準蛋白溶液進行比色,測定光密度值。以蛋白濃度為橫坐標,光密度值為縱坐標,繪制標準曲線。3樣品的測定(1)樣品的提取:稱取鮮樣05g,用5Ml蒸餾水或緩沖液研磨提取。取10Ml(視蛋白質含量適當稀釋)樣液加入試管中,然后重復步驟2的(2)、(3)、(4),以標準曲線中的0管為空白,測定吸光值。(2)根據吸光值查標準曲線,求出比色液中的蛋白質含量。4結果計算樣品中蛋白的含量(Mgg)CVTV1FW1000(2-1)式中C:查標準曲線值(g);VT:提取液總體積(Ml);FW:樣品鮮重(g);V1:測定時加樣量(Ml)。【注意】還原物質,其他酚類物質及檸檬酸對此反應有干擾。/

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