福林酚法測蛋白

1、福林-酚法的原理 該方法是雙縮脲法的發(fā)展，包括兩步反應：(1)在堿性條件下，蛋白質與銅作用生成蛋白質銅絡合物。(2)此絡合物將試劑磷鉬酸磷鎢酸(FolIn試劑)還原，混合物深藍色(磷鉬藍和磷鎢藍混合物)，顏色深淺與蛋白質含量成正比。此方法操作簡便，靈敏度比雙縮脲法高100倍，定量范圍為5100g蛋白質。FolIn試劑顯色反應由酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸引起，因此樣品中若含有酚類、檸檬酸和巰基化合物，均有干擾作用。此方法的缺點是有蛋白質的特異性影響，即不同蛋白質因絡氨酸、色氨酸含量的不同而使顯色強度稍有不同，標準曲線也不是嚴格的直線形式。【儀器與用具】試管若干；刻度移液管05Ml 1支，1Ml 1

2、支，10Ml 1支；定量加樣器；圓底燒瓶；冷凝管1套(帶橡膠管)；微量滴定管；小燒杯；微量進樣器50l 1支；721分光光度計；恒溫水浴器；研缽；玻棒；離心機；離心管?！驹噭縉A2WO42H2O；NA2MoO42H2O；85H3PO4；濃HCl；LI2SO4H2O；溴水；酚酞指示劑；NA2CO3；NAOH；CuSO45H2O；酒石酸鉀鈉；牛血清白蛋白。所用試劑均為化學純或分析純?！痉椒ā?試劑的配制(1)堿性銅試劑(相當于雙縮脲試劑)的制備首先配制A液：4碳酸鈉(NA2CO3)溶液與0.2MolL氫氧化鈉(NAOH)溶液等比例混合(2NA2CO3，01Mol NAOH)；B液：1硫酸銅(Cu

3、SO45H2O)溶液與2酒石酸鉀鈉溶液等比例混合(0.5CuSO45H2O，0.1酒石酸鉀鈉)。在使用前將A液與B液按501的比例混合即成。此為FolIn酚試劑甲液，此試劑只能使用1天。酚試劑(相當于FolIn試劑)的配備：稱取鎢酸鈉(NA2WO42H2O)100g、鉬酸鈉(NA2MoO42H2O)25g，加蒸餾水700Ml溶解于1500Ml的圓底燒瓶中。之后加入85的H3PO450Ml，濃HCl 100Ml，安上回流裝置(使用磨口接頭，若用軟木塞或橡皮塞時，就必須用錫鉑紙包起來)，使其慢慢沸騰10H。冷卻后加入硫酸鋰(LI2SO4H2O)150g，水50Ml，溴水23滴，不用回流裝置開口煮沸

4、15Min，以釋放出過量的溴。待冷卻后稀釋至1000Ml，并過濾入棕色瓶中，密閉于冰箱中保存(冷卻后溶液呈黃色，倘若仍呈綠色，須再滴加數滴液體溴，繼續(xù)煮沸15Min)。使用時用標準NAOH溶液滴定，以酚酞作為指示劑，滴定終點由藍變灰，滴定后算出酸的濃度。使用時大約加水1倍，使最終濃度相當于1MolL H酸，此為FolIn酚試劑乙液(FolIn試劑)。在測定時要注意，因為酚試劑僅在酸性條件下穩(wěn)定，但此實驗的反應只在PH值為10的情況下發(fā)生，所以當加酚試劑時，必須立即混勻，以便在磷鉬酸磷鎢酸試劑被破壞前即能發(fā)生還原反應，否則會使顯色程度減弱。（2）標準蛋白質溶液的配制 稱取25mg牛血清白蛋白，溶

5、于100Ml蒸餾水中，使最終濃度為250gMl。2標準曲線的繪制（1）取7支試管，編號后，分別加入0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml標準蛋白質溶液，用蒸餾水補足1Ml，使每管含蛋白量分別為0g、25g、50g、100g、150g、200g、250g(必要時可做重復)。(2)在每支試管中用定量加樣器加入5Ml甲液，混勻，于30下放置10Min。(3)在每支試管中噴射加入0.5Ml乙液，立即振蕩混勻，在30下保溫30Min。(4)準確到30Min后，以不加標準蛋白試管中的溶液為空白，在500nM下用1CM光徑的比色杯對系列標準蛋白溶液進行比色，測定光密度值。以蛋白濃度為橫坐標，光密度值為縱坐標，繪制標準曲線。3樣品的測定(1)樣品的提取：稱取鮮樣05g，用5Ml蒸餾水或緩沖液研磨提取。取10Ml(視蛋白質含量適當稀釋)樣液加入試管中，然后重復步驟2的(2)、(3)、(4)，以標準曲線中的0管為空白，測定吸光值。(2)根據吸光值查標準曲線，求出比色液中的蛋白質含量。4結果計算樣品中蛋白的含量(Mgg)CVTV1FW1000(2-1）式中C:查標準曲線值(g)；VT:提取液總體積(Ml)；FW:樣品鮮重(g)；V1:測定時加樣量(Ml)。【注意】還原物質，其他酚類物質及檸檬酸對此反應有干擾。/