ERCC1mRNA表達水平基因檢測標準操作規(guī)程

1、1. 目的：規(guī)范ERCC1mRNA表達水平檢測（熒光定量PCR）操作流程，保證檢測結(jié)果準確性。2. 項目名稱： ERCC1mRNA表達水平檢測。檢測方法：熒光PCR。3. 方法原理：PCR方法結(jié)合熒光探針的體外擴增和檢測技術。4. 儀器：博日熒光定量PCR擴增儀。5. 操作步驟：5.1 樣本RNA提取(樣本室)5.1.1 根據(jù)臨床標本采集、驗收、拒收標準操作規(guī)程接收合格的臨床檢測樣本（同一患者的正常組織樣本和腫瘤組織樣本各一份）。5.1.2 從試劑盒中取出組織RNA提取需要用到的試劑, 室溫融化后，2000rpm離心10sec；5.1.3 參照組織樣本RNA提取標準操作規(guī)程提取正常組織樣本和腫

2、瘤組織樣本的RNA。5.1.4 提取的RNA樣本需要在24小時內(nèi)進行逆轉(zhuǎn)錄操作，否則需置于-80保存。5.1.5 RNA提取后剩余的組織樣本置于-80保存，備查。5.2 樣本RNA的逆轉(zhuǎn)錄5.2.1 取出ERCC1-RT-PCR反應液和引物，按要求稀釋溶解引物，室溫融化并振蕩混勻后，2000rpm離心10sec。5.2.2 參考根據(jù)RNA逆轉(zhuǎn)錄標準操作規(guī)程設計針對ERCC1基因的RT-PCR擴增。5.2.3 根據(jù)RNA樣本數(shù)，確定RT-PCR擴增反應管數(shù)，按5.2.4表計算反應混合液的用量，分裝入每個PCR反應管中，振蕩混勻，2000rpm離心10sec后，49l/管；注意避免產(chǎn)生氣泡，蓋好管

3、蓋后經(jīng)傳遞倉轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。（試劑準備室）5.2.4 單管RT-PCR反應液配制（50ul體系）： 2mRNA Selective PCR Buffer 25ul MgCl2 10ul dNTPs/analog Mixture 5ul RNA酶抑制劑 1ul 逆轉(zhuǎn)錄酶 1ul DNA聚合酶 1ul 上游引物F 1ul 下游引物R 1ul ddH2O 4ul 樣本 1ul5.2.5 加樣（樣本處理室）5.2.5.1 PCR反應管中分別加入不同樣本提取的DNA模板各1l（在生物安全柜中進行操作）； 5.2.5.2 應將樣本直接加入反應液內(nèi)，避免樣本粘附在管壁上，蓋緊管蓋充分混勻后低速離心10se

4、c，轉(zhuǎn)移至擴增區(qū)。5.2.6 RT-PCR擴增反應(擴增室)5.2.6.1 將反應管排好放入PCR擴增儀內(nèi)，記錄樣本擺放順序；5.2.6.2 反應循環(huán)條件設置（參照博日PCR儀使用、維護、校準標準操作規(guī)程）： 50 15min 1cycle 85 1min 45 1min 25cycle 72 1min 反應體系為50l。5.2.7 反應結(jié)束后，取RT-PCR反應液（510ul）進行瓊脂糖凝膠電泳，確認PCR擴增產(chǎn)物為目標DNA片段，-20保存。5.3 熒光定量實驗5.3.1 擴增試劑準備（試劑準備室）5.3.1.1 從試劑盒中取出ERCC1熒光定量PCR反應液、Taq酶、引物、探針，室溫融化

5、并振蕩混勻后，2000rpm離心10sec；5.3.1.2 確定檢測反應管數(shù)為n（n樣本數(shù)4管不同濃度梯度的標準品陰性對照）按5.3.1.3表計算反應體系(40ul)各試劑的用量，加入一適當體積離心管，充分混勻，2000rpm離心10sec后分裝入每個PCR反應管中，38l/管；注意避免產(chǎn)生氣泡，蓋好管蓋后轉(zhuǎn)移至樣本處理室。5.3.1.3 單個檢測反應體系配制表：ddH2O 27.2ulPCR buffer 4ul dNTPs 4ul Primer F 0.8ulPrimer R 0.8ul特異性探針 0.8ulTaq酶 0.4ul模板 2ul5.3.2 加樣（樣本處理室）5.3.2.1 將樣

6、本RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物從-20取出，置室溫解凍，2000rpm離心10sec；5.3.2.2 在PCR反應管中分別加入正常樣本RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、病變樣本RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及試劑盒中不同濃度梯度的標準品2l；陰性對照管中加入2ul滅菌超純水。5.3.2.3 應將樣本直接加入反應液內(nèi)，避免樣本粘附在管壁上，蓋緊管蓋充分混勻后低速離心10sec，轉(zhuǎn)移至擴增區(qū)。5.3.3 PCR擴增（擴增室）5.3.3.1 將PCR反應管排好放入博日熒光定量PCR儀內(nèi)，記錄樣本擺放順序。5.3.3.2 設置PCR反應參數(shù)（參照博日熒光定量PCR儀）：循環(huán)條件設置：95：10min；95：10sec；60：40sec； （4

7、0個循環(huán)）。反應體系為40l。儀器檢測通道選擇：熒光信號收集：Fam熒光素；收集溫度：60。（應確嚴格保同一患者的正常樣本與病變樣本的擴增條件一致）5.3.3.3 將實驗結(jié)果保存在設定的結(jié)果保存盤中。5.3.3.4 擴增反應結(jié)束后，立即取出反應管，密封在專用塑料袋中，丟棄到廢物處理室，統(tǒng)一按照醫(yī)療廢物處理條例處理。6. 結(jié)果分析條件設定：6.1 打開博日熒光定量PCR儀的結(jié)果分析軟件，導入保存的實驗數(shù)據(jù)。6.2 使用樣點擬合法，進行結(jié)果分析，構建標準品的標準曲線。6.3 進行結(jié)果分析時基線的確定：取310或315個循環(huán)的熒光信號。閾值可根據(jù)儀器噪音容限來調(diào)整。閾值設定原則以閾值線剛好超過正常陰

8、性對照品擴增曲線的最高點為準；6.4 避免漏檢強陽性樣本，應首先將基線定為310個循環(huán)熒光信號觀察分析Ct值，如果沒有Ct值16.0的樣本，則將基線改定為315個循環(huán)的熒光信號進行結(jié)果分析。熒光曲線標準曲線7. 質(zhì)控標準：7.1 陰性對照的檢測結(jié)果應為陰性；7.2 空白對照的Ct值應等于40.0；否則，此次實驗視為無效。7.3 標準曲線的相關系數(shù)大于0.99；否則，此次試驗視為無效。8. 結(jié)果判斷：8.1 根據(jù)標準品構建的標準曲線，并根據(jù)樣本的Ct值計算出樣本的底物濃度。8.2 比較標準曲線上計算出正常樣本與病變樣本的底物濃度，可以判斷患者病變組織樣本中的mRNA表達水平。比較結(jié)果ERCC1mRNA表達水平正常樣本濃度低于病變樣本濃度病變組織mRNA為高水平表達正常樣本濃度高于病變樣本濃度病變組織mRNA為