Elisa影響因素及措施整理

1、一、 一般檢測試劑盒或檢測試劑從冷藏或冷凍狀態(tài)拿到室溫使用需先在室溫下平衡30 60 min，各試劑在使用前充分混勻。酶標儀測定結果，準確性決定于ELISA板底的平整與透明度、酶標儀的質(zhì)量和軟件的算法。二、 操作不當導致1、 加樣多、操作持續(xù)時間長，尤其是環(huán)境溫度高時會導致個板孔間反應進程差異；2、 除包被外，都宜采取45加樣，且要避免加到側壁上；3、 加樣器不穩(wěn)定、槍頭不均一、試劑濺出、操作習慣不好等造成空間加樣量不均一會對結果造成較大影響。4、 孵育時間過長，會導致非特異性反應增強；5、 顯色和終止加液時應避免氣泡產(chǎn)生，以免影響檢測讀數(shù)；6、 酶標板不宜疊放以減少受熱不均，可采取水??；7、

2、 貼密封膜，防止污物浸入和液體蒸發(fā)。8、 Elisa實驗用的各試劑都要妥善配置和保存、避免污染，不合格的蒸餾水都可導致空白值或背景值升高。三、 檢測樣品處理不當引起溶血或污染1、 血清或血漿標本分離不好或發(fā)生溶血，紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標記的ELISA測定中，溶血標本可能會增加非特異性顯色；2、 待檢標本污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會產(chǎn)生假陽性反應；3、 在冰箱中保存過久的標本，在間接法ELISA測定中會導致本底過深、造成假陽性；4、 標本凝固不完全：血液通常在采集后半小時后開始凝固，1824h完全凝固。如果在血液未凝固時即離心分離血清，則可因纖維蛋白

3、原非特異吸附于微孔而造成假陽性結果。為了縮短標本處理時間，可以在離心前將血液標本置于溫箱中溫育或者采用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當?shù)拇倌齽┮约铀傺宓姆蛛x。5、 標本的反復凍融會因其所產(chǎn)生的機械剪切力對標本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用，使抗體效價跌落從而引起假陰性結果，所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測，宜少量分裝凍存。此外，標本在凍存時會因蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，因此重新融解的標本必須混勻，但不要進行劇烈振蕩，反復顛倒即可，產(chǎn)生泡沫或樣品的過度混合將引起血清蛋白的變性。6、 地高辛、類AFP樣物質(zhì)等，是與靶抗原有交叉反應的物質(zhì)。在用多抗測定抗原時對測定結果影響不大，但在用單克隆抗

4、體測定抗原時，如果交叉抗原決定簇正好是所用單克隆抗體對應的靶決定簇時，也會出現(xiàn)假陽性結果。7、 黃疸血標本中常含有內(nèi)源性過氧化物酶，如用辣根過氧化物酶為標記物，就有可能產(chǎn)生非特異性顯色。血清脂質(zhì)過高、血紅蛋白及血液粘度過大等，都會對Elisa結果產(chǎn)生較大影響。8、 標本管中添加物質(zhì)的影響 抗凝劑(如肝素、EDTA)、酶抑制劑(如NaN3可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過氧化物酶活性)及快速分離血清的分離膠均對ELISA測定有一定的干擾作用。標本為血清，最好將血液先于室溫放置l-2h后，再用3000rpm離心l0 min；標本若為血漿，必須使用含抗凝劑的血液標本收集管，采血后立即顛倒采血管混合5-10

5、次，放置一段時間后，3000rpm離心15 min；血清標本宜在新鮮時檢測，如在冰箱中保存過久，其中的蛋白質(zhì)可發(fā)生聚合，在間接ELISA中可使本底加深。一般4放置的血清標本應在5天內(nèi)測定，再長時間需低溫-20或-80凍存樣品。凍結血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應充分混勻，且要避免產(chǎn)生氣泡。四、 內(nèi)源性干擾因素內(nèi)源性干擾因素一般包括類風濕因子、補體、高濃度的非特異免疫球蛋白、異嗜性抗體、某些自身抗體、因使用鼠抗體治療或診斷誘導的抗鼠Ig抗體、交叉反應物質(zhì)等。在日常的臨床血清（漿）標本中，有相當比例不同程度的含有上述各種干擾物質(zhì)，從而導致測定結果的假陽性。1、類風濕因子（rheumatoi

6、d factors，RF）在類風濕患者、其他疾病患者以及正常人血清中，常含有較高或不同濃度的RF，RF一般為TgM型，亦有IgG和IgA型，RF具有與變性IgG產(chǎn)生非特異結合的特點，因為在ELISA測定中，其可與固相上包被的特異抗體IgG以及隨后加入的酶標的特異抗體IgG結合，從而出現(xiàn)假陽性結果。尤其是在捕獲法IgM型特異抗體的測定中表現(xiàn)最為明顯，因為此時固相包被的抗體為抗人弘鏈抗體，IgM型RF的存在可使其大量結合于固相。為避免RF對ELISA測定的干擾，通?？梢圆扇∠率龃胧?）稀釋標本：這在判斷急性病原體感染的特異IgM抗體如抗HAV IgM，抗HBc IgM， TORCH的IgM抗體檢

7、驗等尤為有用。因為急性感染時，血循環(huán)中特異的IgM抗體滴度通常很高，而RF滴度通常相對要低得多。因此，在測定前對標本進行稀釋，特異的IgM因高滴度存在仍可檢出，而非特異的RF則會因為稀釋變成非常低的滴度，從而對測定幾乎不產(chǎn)生干擾。有些特異IgM檢測ELISA試劑盒不要求稀釋標本，直接檢測，這樣雖然方便了實驗室技術人員的操作，但容易出現(xiàn)假陽性結果，并且由于某些慢性感染，如HBV的感染，血循環(huán)中抗HBe lgM可持續(xù)以一定的滴度存在，標本不做稀釋即進行檢測，即可出現(xiàn)陽性結果，從而失去抗HBc lgM用于HBV急性感染的診斷價值。因此，在臨床實驗室，一定要使用要求對標本做1:1000稀釋的試劑盒進行

8、檢驗，從而保證相應檢測項目結果的可靠性及臨床應用價值。2）改變酶標抗體：由于RF結合的是IgG的Fc片段，如果將待酶標抗體的Fc片段切除，僅留下具有特異結合功能的Fab部分做酶標，在測定中即可避免RF的干擾。3）標本中RF用變性IgG預先封閉：將經(jīng)熱變性（63，10min）的動物如兔、羊等的IgG加入到標本稀釋液中，或是將該變性IgG連接至一顆粒固相如聚苯乙烯微球或微孔，然后加入臨床血清標本，反應后，再吸出標本進行檢測。此外，在測定特異IgM時，也可使用抗人IgG去除臨床標本中RF和IgG。4）測定抗原時，可在標本中加入可使RF降解的還原劑：如2-巰基乙醇等還原劑可使抗體內(nèi)的巰基裂解，因而可以

9、去除RF的干擾，但只適用于抗原測定。5）包被或酶標二抗使用特異的雞抗體IgY：RF不與雞IgY反應，如果包被和酶標二抗均為雞IgY抗體，則不受標本中RF的干擾。2.補體在固相酶免疫測定中，來自哺乳動物的固相特異抗體和酶標二抗均有激活人補體系統(tǒng)的功能。一方面，固相抗體和酶標二抗可因為其在固相吸附及結合過程中，抗體分子發(fā)生變構，從而其Fc段的補體C1結合位點被暴露出來，這樣C1就成為一個中介物將二者交聯(lián)起來，從而出現(xiàn)假陽性結果。另一方面，固相抗體也會因為活化補體的結合，封閉抗體的抗原表位結合能力，而引起假陽性結果或使定量測定結果偏低。由補體引起的干擾可通過下述方法避免：（1）對臨床血清標本加熱滅活

10、補體：采用5630min加熱可使標本中的補體C1滅活。（2）包被抗體或酶標二抗使用特異的雞抗體：雞抗體不激活人的補體系統(tǒng)，因此，使用特異的雞抗體，不會出現(xiàn)因補體激活而存在的假陽性和假陰性干擾。3、異嗜性抗體（heterophilie antibodies）人類血清中含有抗嚙齒類動物（如鼠、馬、羊等）的免疫球蛋白（lg）的抗體，即天然的異嗜性抗體。有研究表明，天然的異嗜性抗體（lgG）可分為兩類，一類（85%的假陽性由其引起）可結合于山羊、小鼠、大鼠、馬和牛IgG的Fab區(qū)域，但不與兔IgG的Fab區(qū)結合。另一類（15%的假陽性由其引起）可結合于小鼠、馬、牛和兔IgG的Fc區(qū)表位，但不與山羊和大

11、鼠IgG的Fc區(qū)表位結合。異嗜性抗體可通過交聯(lián)固相和酶標的單抗或多抗而出現(xiàn)假陽性反應。由異嗜性抗體引起的干擾可通過下述方法避免：（1）使用特異的兔F（ab）2片段作為固相或測定酶標抗體。（2）在標本或標本稀釋液中加入過量的動物Ig，封閉可能存在的異嗜性抗體。但加入量不足或亞類不同時無效。（3）使用靶特異的非Ig親和蛋白（affibody）替代固相或酶標抗體之一。采用噬菌展示來自單個金黃色葡萄球A蛋白（SPA）聯(lián)合文庫的人IgA結合親和蛋白，用于IgA的測定，不受異嗜性抗體的影響。4、人抗動物抗體（HAAA）的干擾HAAA有IgG、IgA、IgM和IgE屬，可分為抗獨特型和抗同種型，有多種動物I

12、gO抗兔、抗山羊抗體作為免疫分析的第二抗體。由于不同動物Ig分子間蛋白質(zhì)序列有大量同源性，因此多種動物Ig之間會發(fā)生交叉反應。HAAA可由醫(yī)源性和非醫(yī)源性因素引起。前者是人體免疫系統(tǒng)對藥用性蛋白的正常應答。動物身上可得到的藥劑非常多，如：鼠McAb的靶向性藥物或成像劑、馬抗毒素和抗胸腺細胞Ig、羊抗地高辛Fab、嵌合抗體和胰島素等。另外還有輸血和接種疫苗等途徑。它們的存在會對體外的免疫分析產(chǎn)生干擾，也會使治療抗體失活和干擾小鼠McAb治療和成像。由人抗鼠抗體（HAMA）引起的干擾可通過下述方法避免：（1）使用的特異的抗體F(ab)2:片段作為固相或測定酶標抗體。（2）在標本或標本稀釋液中加入過

13、量的鼠Ig，封閉可能存在的抗鼠抗體。（3）使用特異的雞抗體IgG作為固相和測定抗體。雞IgG不與人抗鼠抗體反應。因而，用其作為固相或酶標抗體不會出現(xiàn)假陽性結果。雙位點免疫分析中，血清中的HAMA能夠非特異性橋聯(lián)捕捉抗體和示蹤抗體而導致假陽性，而假陰性是由于HAAA與捕捉抗體、示蹤抗體其中之一結合，使它們不能與分析物結合。Id的干擾機制和HAMA類似。形成Fab-Fab結構。另外分析用抗體Fc片段也會和干擾抗體結合形成干擾物。Id和HAAA的干擾，在競爭性結合分析中很少報道，可能是由于抗原和抗體間的高親和力，使得HAAA很難與抗原競爭，但當HAAA濃度很高時，也同樣造成了干擾。5.自身抗體 自身

14、抗體如抗甲狀腺球蛋白、抗胰島素等，能與其相應靶抗原結果形成復合物，在ELISA方法中可干擾相應原抗體的測定。為避免以上情況出現(xiàn)，可在測定前用理化方法將其解離。6. 溶菌酶溶菌酶可與等電點較低的蛋白有強的結合能力。免疫球蛋白等電點約為5，因此，在雙抗體夾心法ELISA測定中，溶菌酶可在包被的IgG和酶標的IgG間形成橋接，從而導致假陽性。因此，為保證ELISA測定的可靠性，有必要從標本中去除溶菌酶或?qū)⑵浞忾]，Cu2+離子和卵白蛋白可有效地封閉溶菌酶，防止其連接IgG。五、 抗原抗體反應特性導致的影響1、表面效應首先必須明確指出的是，“固相”ELISA與傳統(tǒng)的“液相”血清學試驗的最大最本質(zhì)的區(qū)別是

15、有一個預先固相抗原或抗體到載體表面的步驟，以及抗原與抗體結合反應由液態(tài)環(huán)境移到了固相載體表面進行。蛋白質(zhì)分子在吸附過程中，為了克服與固相載體之間的排斥力，需要重新分布其表面的功能性基因，使疏水性基因充分暴露，然后，局部接觸區(qū)域的偶極分子脫氫，再通過范德華吸引而固相到載體表面。表面效應可直接影響抗原、抗體的構象和功能。此外，表面效應亦影響抗原和抗體結合反應的動力學過程。（1）固相導致抗原的變化。為了測定抗體水平，需預先將抗原固相（包被）到極性和疏水性的聚苯乙烯（PS）或聚氯乙烯（PVC）酶標板上。用直接物理吸附方法固相蛋白抗原及DNA等，導致的變化是多方面的，可引起分子構象和抗原性發(fā)生改變。酶活

16、性測定時可消失。牛血清白蛋白固相之后，其抗原價可由5價降為1價。此外，發(fā)現(xiàn)被動吸附方法固相鐵蛋白呈團串狀不均一的隨機分布，這種影響質(zhì)控的情況具有普遍性。最后，大多數(shù)小分子半抗原不易直接吸附到載體表面。解決這一難題的方法，一般是采用在小分子抗原上先偶聯(lián)上葡聚糖、明膠等手臂后再進行固相包被。對于有多重表達抗原決定簇的大分子抗原，用抗體橋式包被法可避免表面效應的影響。將蛋白抗原吸附于膠體AI（OH）3后再固相也可以避免蛋白變性。用Y射線輻照（400GY）PS板，不但可增加蛋白抗原吸附能力，而且還有降低抗體測定本底的作用。（2）、固相對抗體的影響。直接吸附固相抗體（Igs）分子，除了呈團串狀，不均分布

17、和易解吸等一般不利因素之外，Igs分子攤開在載體表面，不但構象發(fā)生改變，而且影響抗體的活性，如IgG的結合價減少，可由2價變?yōu)?價，甚至完全失活。實驗結果表明，單克隆抗體比多克隆抗體更易失活，固相后仍能保持結合能力的分子僅占少數(shù)，分別為3%和5%-10%。這不但浪費抗體試劑，更可惜的是空置了有限的微孔表面積?？贵w分子N末端為Fab，C末端為Fc，直接被動吸附的隨意性，造成一部分Fab結合位點朝向載體一面，或因用量過多而造成的重疊吸附，部分Fab結合位被遮蓋，均可導致其總體結合能力下降。為此，出現(xiàn)了可以“錨定”F段在載體表面，而使Fab朝外的共價結合法，即在載體上導入氨基、肼基等活性基因，然后在

18、水溶性碳二胺作用下，與Igs的羧基共價結合，或直接與羥基化糖基產(chǎn)生的醛基共價結合：含溴乙烯基團的PS板，可在雙功能交聯(lián)劑如戊二醛的幫助下與蛋白質(zhì)共價結合。目前，國外已有有關的酶標板產(chǎn)品（專利）供應。橋式法是一種避免Igs與載體直接接觸的固相方法，有幾種不同的類型：1）抗抗體法：（二抗橋接錨定）；2）SPA法：葡萄球菌A蛋白（staphylococcal protein，SPA）固定抗體；3）鏈酶親和素-生物素法，此方法應用最為成功，只要預先將第一捕捉抗體生物素化；4）抗半抗原抗體法，這需要將捕捉體預先記半抗原。（3）、抗體介導的抗原分子變構。抗原與抗體分子在三維立體空間自由運動，互相碰撞，彼此

19、特異性結合，這種結合不似早期相像中的單純的“鎖-匙”關系，而是一種柔性的誘導契合。抗原分子決定簇可以突入到Fab的深底部，反過來，F(xiàn)ab為了執(zhí)行其固有生物學功能，主動地發(fā)生變角折彎，錐形轉(zhuǎn)動及最N末端可變區(qū)的“球穴”擺動，以契合抗原決定簇，F(xiàn)ab亦可突入到大分子抗原的較深的位區(qū)。液態(tài)中的抗原體分子在完成一級結合反應之后，該復合物可以通過抗原抗體之間的特異性結合，亦可通過抗體Fc-Fc段的非特異性結合而進一步交聯(lián)，形成肉眼可見的晶格形網(wǎng)絡沉淀凝集型的抗原抗體二級反應復合物。縱觀全過程，抗原分子一般總能保持其固有的構象，而復合物中的抗體構象變化則較大。相反，在固相抗體測定抗原的過程中，由于表面效應

20、的關系，抗體介導的抗原分子變構具有特殊意義。2、HD-HOOK效應這種發(fā)生在固相法實驗過程中的可造成“假低值”甚至“假陰性”錯誤結果的特殊效應，稱為“高劑量鉤鐮（HD-HOOK）效應”。它的產(chǎn)生條件、分子基礎、導致的后果等，都與傳統(tǒng)的液相沉淀、凝集反應中的“區(qū)帶現(xiàn)象”不一樣。在一步二位點夾心ELISA中，主要是“濃度效應”既待測物中抗原數(shù)量過高所致，此競爭結合反應系統(tǒng)中的標記二抗限量，從而產(chǎn)生抗原越多，最終反應信號越低的HD-HOOK效應；次要因素是標記抗體與被捕捉抗原的交叉重疊結合而導致抗原變構?？乖傲俊笔菦Q定的因素。一般認為二步二位點夾心固相測定法不會產(chǎn)生抗原過剩的“陰滯現(xiàn)象”，此觀點早已被Miles的實踐否定，只是很少有二步夾心法會產(chǎn)生HD-HOOK