第一章 基因工程的分子生物學(xué)基礎(chǔ).ppt

1、第一章 基因工程的分子生物學(xué)基礎(chǔ),授 課 人：余春梅 授課學(xué)院: 南通大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,基因工程的概念,細(xì)胞外用各種方法產(chǎn)生的核酸分子插入載體分子中，形成遺傳物質(zhì)的新組合，最終整合摻入到本來(lái)不含這些核酸分子的宿主生物中，并進(jìn)行復(fù)制繁衍。 遺傳工程、基因操作、重組DNA技術(shù)等,基因工程誕生的理論基礎(chǔ),-證明了DNA是遺傳物質(zhì) -雙螺旋模型 - 遺傳密碼子的破譯 1）不同的基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ) 2）基因是可切割的 3）基因是可以轉(zhuǎn)移的 4）多肽與基因之間存在對(duì)應(yīng)關(guān)系 5）遺傳密碼是通用的 6）基因可以通過(guò)復(fù)制把遺傳信息傳遞給下一代。,基因工程的技術(shù)基礎(chǔ),工具酶：DNA連接酶 內(nèi)切酶 反轉(zhuǎn)錄酶 P

2、CR技術(shù) 載體技術(shù) 基因轉(zhuǎn)移技術(shù),第三節(jié) 基因工程中采用的主要酶類,一、序列特異的DNA限制性內(nèi)切核酸酶,（一）限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn) 宿主細(xì)胞的限制和修飾作用,1 、宿主細(xì)胞的限制和修飾作用： 兩種不同來(lái)源的入-噬菌體K； C，能高頻感染各自大腸桿菌宿主細(xì)胞（ K株，C 株 ）。 當(dāng)它們分別與其它宿主菌交叉混合培養(yǎng)時(shí)，感染下降數(shù)千倍。一但K 噬菌體在C株成功，由C株繁殖出K后代，能感染C株, 不能感染原來(lái)K株.,(二 )限制和修飾作用的分子機(jī)制,1大腸桿菌宿主細(xì)胞 K株，C株 ，有各自的限制和修飾系統(tǒng)。 1）它們均有三個(gè)連續(xù)的基因位點(diǎn)控制，hsdR; hsdM; hsdS. 2）hsdR編碼限制

3、性核酸內(nèi)切酶-識(shí)別DNA分子特定位點(diǎn)，將雙鏈DNA切斷。 3）hsdM編碼產(chǎn)物是DNA甲基化酶-催化DNA分子特定位點(diǎn)的堿基甲基化反應(yīng)。 4） hsdS表達(dá)產(chǎn)物的功能是-協(xié)助限制性核酸內(nèi)切酶和甲基化酶，識(shí)別特殊的作用位點(diǎn)。,(二)、限制和修飾作用的分子機(jī)制,2. 入噬菌體長(zhǎng)期生長(zhǎng)在大腸桿菌宿主細(xì)胞 K株，C株 中， 1）宿主細(xì)胞甲基化酶，將染色體DNA和噬菌體DNA特異性保護(hù). 2）封閉自身所產(chǎn)生的核酸內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)（修飾） 3當(dāng)外來(lái)DNA入侵時(shí)，遭到宿主限制性內(nèi)切酶的特異降解（限制） 4. 由于降解不完全，外來(lái)少數(shù)DNA分子在宿主細(xì)胞中繁殖過(guò)程中被宿主細(xì)胞的甲基化酶修飾，雖然是外來(lái)卻不被降

4、解。,5但喪失在原宿主細(xì)胞中的存活能力，因?yàn)榻邮芰诵滤拗骶谆揎椀耐瑫r(shí)喪失了原宿主菌修飾的標(biāo)記(一但K噬菌體在C株成功，由C株繁殖出K 后代，能感染C株, 不能感染原來(lái) K株) 6細(xì)菌利用限制和修飾系統(tǒng)來(lái)區(qū)分自身DNA與外來(lái)DNA。 B株不能產(chǎn)生限制性內(nèi)切酶，其它來(lái)源入-噬菌體可以感染B株，在B株繁殖，入-噬菌體則在 K株和 C株 受到嚴(yán)格的限制作用,(二) 限制和修飾作用的分子機(jī)制,(三) 限制性內(nèi)切酶的分類,（四）限制性內(nèi)切酶切割特點(diǎn),1、識(shí)別位點(diǎn) 一般為4-8個(gè)bp的回文序列 大多數(shù)酶作用于底物DNA雙鏈，位點(diǎn)在識(shí)別序列中或靠近識(shí)別序列 少數(shù)酶能作用于回文序列相應(yīng)DNA單鏈序列,限制

5、性內(nèi)切酶切割特異位點(diǎn)的機(jī)理,（四）限制性內(nèi)切酶切割特點(diǎn),平末端： 兩條鏈上的斷裂位置是處在一個(gè)對(duì)稱結(jié)構(gòu)的中心，形成的DNA片段具有平末端。 黏性末端：指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互補(bǔ)堿基的單鏈延伸末端結(jié)構(gòu)，它們能夠通過(guò)互補(bǔ)堿基間的配對(duì)而重新環(huán)化起來(lái)。 5突出的黏性末端 3 突出的黏性末端,平末端的DNA片段不易重新環(huán)化,已知有兩種不同的限制酶都可產(chǎn)生粘性末端：,5-P 端突出：,3-OH 端突出：,同尾酶,一組來(lái)源不同識(shí)別序列各異的，但能夠切割形成相同粘性末端的核酸內(nèi)切限制酶。,Hind 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5 Hsu I 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-

6、5,同裂酶（isoschizomers）,有一些來(lái)源不同的限制性內(nèi)切酶能識(shí)別并切割相同的核苷酸靶序列，這類酶稱為同裂酶。,限制酶識(shí)別與切割的靶點(diǎn)序列及其隨后的連接同DNA的來(lái)源無(wú)關(guān)，即不帶有種的特異性，對(duì)各種DNA普遍適用 。 根據(jù)這一特性，才能將不同來(lái)源的DNA片段重組成新的重組體分子或是新的基因。,從生物秀網(wǎng)站下載,二、連接酶,（一）DNA連接酶的作用模式,1、連接酶：能夠催化兩條雙鏈DNA鏈之間形成5，3磷酸二酯鍵的酶,5末端形成DNA腺苷酸復(fù)合物,（二） DNA連接酶的兩種類型,類型 I：E. coli DNA 連接酶（只連接粘末端） 利用NAD（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）作為能量供體，主

7、要來(lái)源于原核生物 類型 II：T4 DNA連接酶（粘末端和平末端） 利用ATP作為能量供體，主要來(lái)源于真核生物，T4噬菌體也屬于此類 在基因工程的實(shí)驗(yàn)中主要用T4 DNA連接酶,（三） 條件,（1）連接所需的條件 一條DNA鏈的3末端具有一個(gè)游離的羥基（-OH），而在另一條DNA鏈的5末端具有一個(gè)磷酸基團(tuán)（-P）； （2）需要有一種能源分子存在以提供羥基與磷酸基團(tuán)之間形成磷酸二酯鍵時(shí)所需的能量。 大腸桿菌及其它細(xì)菌中：NAD+（氧化氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸） 動(dòng)物細(xì)胞及噬菌體中： ATP,OH3,5P,（四）注意,被連接的兩條DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分，DNA連接酶并不能連接兩條

8、單DNA分子或環(huán)化的單鏈DNA分子。 DNA連接酶只能連接并封閉雙螺旋DNA分子所出現(xiàn)的切口（Nick），即封閉雙鏈DNA上兩個(gè)相鄰核苷酸之間失去一個(gè)磷酸二酯鍵所出現(xiàn)的斷裂,GGTAC-OH P-C C-P HO-CATGG,5 3,3 5,GG-OH P-CC CCATGG,5 3,3 5,GGTACC CCATGG,5 3,3 5,三、激酶及堿性磷酸酯酶,堿性磷酸酯酶：除去DNA 5磷酸的酶 激酶：在DNA或RNA的5羥基(OH)端進(jìn)行磷酸化的酶（作用結(jié)果是添加磷酸，可用于核酸的末端標(biāo)記）,四、DNA聚合酶和RNA聚合酶,DNA聚合酶（來(lái)自大腸桿菌） 功能：53 的聚合酶活性。53外切核酸

9、酶活性， 3 5外切核酸酶 利用：53 的聚合酶活性以及53外切核酸酶活性，切口平移,Taq DNA聚合酶（來(lái)自耐熱細(xì)菌） 具有53 的聚合酶活性和3 5外切核酸酶，高度保真，產(chǎn)生平末端，不能進(jìn)行TA克隆 測(cè)序酶：具有53 的聚合酶活性，但不具備3 5外切核酸酶的T7DNA聚合酶。 反轉(zhuǎn)錄酶：以RNA為模板合成DNA 的聚合酶,第四節(jié) 研究DNA和RNA的方法,一、核酸的分離純化 通過(guò)各種方法將生物材料破碎，釋放DNA（RNA）至溶液中，去除雜質(zhì)（如用苯酚萃取蛋白質(zhì)），再用乙醇沉淀核酸，通過(guò)離心，分離純化核酸，最后用低濃度鹽溶液溶解核酸。,1、細(xì)菌培養(yǎng)物的生長(zhǎng)和收集 確定成分的培養(yǎng)基(defi

10、ned medium)，M9 不確定成分的培養(yǎng)基(undefined medium)， 如LB 蛋白胨：提供氨基酸和小的肽段 酵母提取物：提供氮源，糖類以及其它有機(jī)與無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng),實(shí)例1：細(xì)菌DNA的提取,2、細(xì)胞提取物的制備 細(xì)菌細(xì)胞的屏障:細(xì)胞膜和細(xì)胞壁 物理方法與化學(xué)方法 化學(xué)方法: 溶菌酶(消化細(xì)胞壁多聚物) EDTA(螯合鈣離子, 抑制DNA酶的活性) SDS:去污劑,協(xié)助細(xì)胞壁的裂解,實(shí)例1：細(xì)菌DNA的提取,3 從細(xì)胞提取物中純化DNA 降解雜質(zhì),留下DNA(苯酚與氯仿的混合物,RNA酶) 離子交換層析,分離DNA(帶正電荷的離子交換劑) 4 DNA取樣的濃縮 乙醇沉淀(破壞了DNA

11、分子間的氫鍵) 5 DNA濃度的測(cè)量 A260/A280=1.8,實(shí)例1：細(xì)菌DNA的提取,植物葉片用液氮碾磨成細(xì)末后轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管 加650l 在65度預(yù)熱的CTBA提取液 水浴鍋中65溫浴40分鐘后取出，靜置冷卻 加入650l苯酚：氯仿（1：1）混合液，上下顛倒混勻，靜置5分鐘 12000rpm 離心10 分鐘,實(shí)例2：植物DNA的提取,取上清液，加入2l（10mg/ml）Rnase,37 度水浴30分鐘 再抽提一次 取上清液，加入2倍體積的冷乙醇或等體積的異丙醇 輕輕搖動(dòng)，待發(fā)現(xiàn)有白色絮狀沉淀，用牙簽挑出或6000rpm離心5分鐘 70%的乙醇洗后，涼干。,實(shí)例2：植物DNA的提

12、取,實(shí)例3 質(zhì)粒DNA的制備,1 基于分子大小的分離 2 基于構(gòu)象的分離 質(zhì)粒有三種構(gòu)型 cccDNA(共價(jià)閉環(huán)DNA)：DNA的兩條鏈都是完整的。 ocDNA(開(kāi)環(huán)DNA)：只有一條鏈?zhǔn)峭暾摹?線性DNA：DNA的兩條鏈均被打開(kāi)。多種細(xì)菌中存在線性的質(zhì)粒DNA。但末端或是通過(guò)重復(fù)序列形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)或通過(guò)共價(jià)結(jié)合蛋白進(jìn)行保護(hù)，避免核酸酶的降解。,堿變性 用CsCl-EB等密度離心,Ethidium bromide (EB),包含質(zhì)粒的細(xì)胞,用溶菌酶弱化細(xì)胞壁，用NaOH和SDS溶液裂解,變性的染色體 DNA,用acidic sodium acetate 中和,染色體DNA復(fù)性 形成不溶的網(wǎng)狀物

13、 高濃度的acidic sodium acetate使 protein-SDS 復(fù)合物和高分子量的RNA 沉淀,ccc DNA不發(fā)生變性，以天然狀態(tài)溶解在溶液中,通過(guò)離心去除沉淀,通過(guò)乙醇或異丙醇濃縮沉淀，或用凝膠過(guò)濾方法純化質(zhì)粒DNA。,二、凝膠電泳,根據(jù)DNA或RNA 分子的大小，形狀和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，將DNA和RNA進(jìn)行分離的技術(shù)。 DNA和RNA在膠上的遷移性 DNA或RNA分子帶有負(fù)電荷，在膠支持物上向正電極運(yùn)動(dòng) 線性DNA分子根據(jù)大小進(jìn)行分離，小分子比大分子要泳動(dòng)快，所以能將DNA分子進(jìn)行分離 環(huán)狀DNA分子的移動(dòng)受拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的影響。相同分子量的情況下，超螺旋線性缺刻或松散,二、凝膠電泳,

14、瓊脂糖凝膠 是一種多聚糖，主要由瓊脂糖（agarose，約占80%）及瓊脂膠（agaropectin）組成。 瓊脂糖凝膠電泳常用于分離、鑒定核酸，如DNA鑒定 凝膠孔徑的大小 隨著濃度的增加而變小，有效分離DNA大小范圍為0.210Kb,DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物,水平型平板電泳槽,二、凝膠電泳,聚丙烯胺凝膠 （acrylamide，簡(jiǎn)稱Acr）和交聯(lián)劑N，N-甲叉雙丙烯酰胺（methylane bisacrylamide，簡(jiǎn)稱Bis）在催化劑作用下合成的。 凝膠孔徑的大小決定于兩者的總濃度以及比值 分辨率比較高，能區(qū)分12bp 差別的DNA/RNA分子，但只能分離幾百bp的DNA/RNA分子,

15、三、 DNA測(cè)序,鏈終止法測(cè)序 化學(xué)降解法測(cè)序（自習(xí)） 自動(dòng)化測(cè)序 非常規(guī)DNA測(cè)序（焦磷酸測(cè)序，芯片測(cè)序等）,1、鏈終止法測(cè)序技術(shù)路線與要求,制備單鏈模板 將單鏈模板與一小段引物退火 加入DNA多聚酶 4種脫氧核苷酸 分別加入少量4種雙脫氧核苷酸 將4種反應(yīng)產(chǎn)物分別在4條泳道電泳 根據(jù)4個(gè)堿基在4條泳道的終止位置讀出基因序列,A 克隆于質(zhì)粒中DNA用堿或熱變性 B M13克隆單鏈DNA C 噬?？寺NA D PCR產(chǎn)生單鏈DNA,A 高酶活性 B 無(wú)53外切酶活性 C 無(wú)35外切酶活性,ddATP/ddCTP/ddGTP/ddTTP 的3碳原子連接的是氫原子,不是羥基,三、DNA測(cè)序,2、

16、自動(dòng)測(cè)序 基本原理 與鏈終止法測(cè)序原理相同,只是用不同的熒光色彩標(biāo)記ddNTP,如ddATP標(biāo)記紅色熒光,ddCTP標(biāo)記藍(lán)色熒光, ddGTP標(biāo)記黃色熒光, ddTTP標(biāo)記綠色熒光.由于每種ddNTP帶有各自特定的熒光顏色,而簡(jiǎn)化為由1個(gè)泳道同時(shí)判讀4種堿基.,制備單鏈模板 將單鏈模板與一小段引物退火 加入DNA多聚酶（4種脫氧核苷酸） 分別加入少量4種熒光標(biāo)記的雙脫氧核苷酸 將產(chǎn)物在一個(gè)泳道上電泳，根據(jù)不同片段的熒光信號(hào)判讀序列,模板制備,PCR 反應(yīng)（測(cè)序反應(yīng)）,電泳,核酸序列閱讀,2、自動(dòng)測(cè)序,2、自動(dòng)測(cè)序,第五節(jié) 膜印跡和核酸雜交,Southern 印跡,第五節(jié) 膜印跡和核酸雜交 So

17、uthern 印跡,大致過(guò)程如下： (1) 提取組織中的DNA，并用內(nèi)切酶消化，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。 (2) 將DNA片段轉(zhuǎn)移到固體支持物(硝酸纖維素濾膜或尼龍膜)上。 (3) 預(yù)雜交濾膜,掩蓋濾膜上非特異性位點(diǎn)。 (4) 讓探針與同源DNA片段雜交,然后漂洗除去非特異性結(jié)合的探針。 (5) 通過(guò)顯影檢查目的DNA所在的位置，以及信號(hào)的強(qiáng)度。,放射自顯影核酸雜交過(guò)程 (photo film),Professor Sir Ed Southern, Whitley Professor of Biochemistry at the University of Oxford,.,School of l

18、ife sciences Nantong University,“Real” Southern blot (DNA-DNA blot),STAINED by Et Br,VIZUALIZED by P32,Southern 印跡的應(yīng)用,限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism, RFLP） RFLP是根據(jù)不同品種（個(gè)體）基因組的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)堿基發(fā)生突變，或酶切位點(diǎn)之間發(fā)生了堿基的插入、缺失，導(dǎo)致酶切片段大小發(fā)生了變化，這種變化可以通過(guò)特定探針雜交進(jìn)行檢測(cè)，從而可比較不同品種（個(gè)體）的DNA水平的差異（即多態(tài)性）。用于構(gòu)建遺傳圖譜，分子診斷等 確定基因組中基因的拷貝數(shù),Northern印跡的應(yīng)用,Northern印跡（P17頁(yè)） 檢測(cè)基因的表達(dá),Western 印跡,這種技術(shù)是把電泳分離的組分從凝膠轉(zhuǎn)移到一種固相支持體，并以針對(duì)特定氨基酸序列的特異性試劑作為探針檢測(cè)之。Western使用的探針是抗體，它與附著于固相支持體的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原表位發(fā)生特異性反應(yīng)。 應(yīng)用：蛋白表達(dá)量的檢測(cè)，組織特異性蛋白定位的檢測(cè)等,一抗,二抗,抗原,第六節(jié) 鑒定特定基因轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn)錄起點(diǎn),對(duì)于轉(zhuǎn)錄的起始點(diǎn)、終止點(diǎn)和基因是否具有內(nèi)含子等的研究 11.1.1電子顯微鏡分析核酸分子,