檸檬酸發(fā)酵工藝1.ppt

1、第一章 檸檬酸發(fā)酵工藝學,三、黑曲霉檸檬酸生產菌的保藏方法,1、斜面低溫保藏法 2、載體吸附保藏法 3、真空冷凍干燥保藏法 4、液氮超低溫（-196）保藏法,是重要的發(fā)酵工業(yè)菌種，可生產淀粉酶、酸性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶、檸檬酸、葡糖酸和沒食子酸等。 黑曲霉在pH為23的環(huán)境中發(fā)酵蔗糖，產物以檸檬酸為主，只產極少量的草酸；當pH接近中性時則大量產生草酸， 而檸檬酸產量很低。,2.1 概述 2.2 黑曲霉檸檬酸生產菌的選育及保藏 2.3 檸檬酸發(fā)酵機制及深層發(fā)酵工藝 2.4 檸檬酸的提取和精制 2.5 檸檬酸的質量標準及新工藝新技術,2.3 檸檬酸發(fā)酵機制及深層發(fā)酵工藝條件,第一

2、節(jié) 檸檬酸發(fā)酵機制,一、檸檬酸生物合成途徑 1、黑曲霉檸檬酸生物合成途徑 葡萄糖經EMP、HMP途徑降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脫羧生成乙酰CoA，一方面經CO2固定化反應生成草酰乙酸，草酰乙酸與乙酰CoA縮合生成檸檬酸。,糖酵解途徑 葡萄糖 6-磷酸葡萄糖 6-磷酸果糖 1,6-二磷酸果糖 磷酸二羥丙酮+3-磷酸甘油醛 磷酸二羥丙酮 3-磷酸甘油醛 1,3-二磷酸甘油酸 3-磷酸甘油酸+ATP 3-磷酸甘油酸 2-磷酸甘油酸 磷酸烯醇式丙酮酸 丙酮酸+ATP 激酶凡是催化磷?；IATP分子轉移到受體上的酶，都稱為激酶,HMP途徑 6-磷酸葡萄糖 5-磷酸核酮糖 5-磷酸核糖+5-磷酸木酮

3、糖 6-磷酸果糖+3-磷酸甘油醛 磷酸-D-赤蘚糖+5-磷酸木酮糖 6-磷酸果糖+3-磷酸甘油醛,EMP途徑在黑曲霉檸檬酸生產菌中起重要作用。 研究發(fā)現(xiàn)黑曲霉中存在三羧酸循環(huán)的酶系，證明黑曲霉中存在三羧酸循環(huán)。 研究證實，CO2固定反應對檸檬酸積累具有重要的生理意義。 黑曲霉CO2固定中，存在兩個CO2固定系統(tǒng) 丙酮酸草酰乙酸Keq=0.818 磷酸烯醇式丙酮酸草酰乙酸，Keq=0.049 可見，黑曲霉檸檬酸生產菌中CO2固定反應主要是丙酮酸羧化酶催化的，黑曲霉中已提純出此酶。,檸檬酸生物合成途徑,三羧酸循環(huán)概要,2、酵母檸檬酸生物合成途徑 解脂假絲酵母能利用烷烴、乙醇、乙酸發(fā)酵生成檸檬酸。,

4、酵母（烷烴）檸檬酸生物合成途徑,異檸檬酸裂解酶切割異檸檬酸 產生乙醛酸和琥珀酸,乙醛酸經蘋果酸合成酶催化， 在水的存在下接受乙酰輔酶A的乙酸， 生成蘋果酸。,NAD+ :煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（氧化態(tài)） NADH :煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（還原態(tài)） NADP+ :煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（氧化態(tài)） NADPH :煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（還原態(tài)） NAD+ + H+ + 2e- = NADH NADP+ + H+ + 2e- = NADPH 輔酶，用來實現(xiàn)電子傳遞,二、黑曲霉檸檬酸發(fā)酵的代謝控制,1、黑曲霉檸檬酸積累的代謝調節(jié) 第一個調節(jié)酶是磷酸果糖激酶（PFK酶） 檸檬酸、ATP對該酶有抑制作用

5、： 生產菌需要解除該抑制 AMP、無機磷、NH4+對該酶有活化作用 實驗表明，NH4+能有效的解除檸檬酸、ATP對該酶的抑制作用 因此，生產上添加銨鹽來增加檸檬酸產量 Mn2+的影響： Mn2+缺乏菌體TCA酶活下降 Mn2+缺乏可能干擾蛋白質合成，導致蛋白質分解 減少檸檬酸對該酶的抑制NH4+水平升高,第二個調節(jié)點：CO2固定的酶活力高，保證草酰乙酸的供應 研究證實，檸檬酸的生成速度與CO2固定量有化學計量關系， CO2固定主要是丙酮酸羧化酶催化的，生成了草酰乙酸。 第三個調節(jié)點：TCA環(huán)上的調節(jié) 檸檬酸合成酶，是一種調節(jié)酶，但在黑曲霉中沒有調節(jié)作用 順烏頭酸水合酶、異檸檬酸酶 pH2.0時

6、，失活 阻斷TCA循環(huán) 檸檬酸合成酶活性很高時 積累檸檬酸 順烏頭酸水合酶需要Fe2+ 在發(fā)酵液中添加黃血鹽，絡合Fe2+阻斷TCA循環(huán)，積累檸檬酸 黑曲霉除正常呼吸鏈（產生ATP）之外，還存在一條側呼吸鏈（不產生ATP） 缺氧對側呼吸鏈的損傷是不可逆的，因才在產酸階段，一定要保證足夠的溶氧供應。,三、 黑曲霉檸檬酸的發(fā)酵機制歸納,由于嚴格限制供給錳離子，篩選出耐高濃度金屬離子的菌株，使細胞中形成高水平的銨離子，從而解除了檸檬酸和ATP對PFK酶的反饋抑制，使EMP途徑的代謝流增大。 存在一條呼吸性強的側系呼吸鏈，不產生ATP，缺氧則呼吸鏈失活，細胞內ATP濃度下降，減輕了ATP對PFK酶的抑

7、制，促使EMP途徑的暢通，增加檸檬酸的生物合成。 丙酮酸羧化酶是組成性酶，不受代謝調節(jié)控制，可源源不斷地提供草酰乙酸，丙酮酸氧化脫羧生成乙酰CoA和草酰乙酸的供給，檸檬酸合成酶又基本上不受調節(jié)或極微弱，增強了檸檬酸的合成能力。,-酮戊二酸脫氫酶受葡萄糖（蔗糖）和銨離子阻遏，使黑曲霉中的TCA循環(huán)變成“馬蹄形”的代謝方式，減弱TCA循環(huán)，降低細胞內ATP濃度，另外使-酮戊二酸濃度升高，又反饋抑制異檸檬酸脫氫酶，降低檸檬酸的自身分解。 順烏頭酸水合酶催化時建立檸檬酸：順烏頭酸：異檸檬酸：=90：3：7的平衡，順烏頭酸水合酶的作用總是趨向于合成檸檬酸，即檸檬酸分解活力低。一旦檸檬酸濃度升高到某一水平

8、，就抑制異檸檬酸脫氫酶的活力，從而進一步促使檸檬酸的自身積累，pH降至2.0以下，順烏頭酸水合酶和異檸檬酸脫氫酶失活，更有利于檸檬酸的積累并排出體外。,檸檬酸食用小貼士 常飲酸牛奶：酸奶中含有的乳酸及其它一些有機酸如檸檬酸、葡配合酸等，其稀釋液還具有明顯的殺菌和防腐作用，被譽為粘膜組織的“清洗劑”，它有助于軟化皮膚的粘性表層，去掉死去的舊細胞，在此過程中，皺紋也隨之消除了。 吃水果減肥，是不少女性最喜歡使用的方法之一。每100克檸檬中只含24卡路里熱量。檸檬中的檸檬酸能促進熱量代謝，而且它的維生素C含量是水果中的佼佼者，美白效果好，熱量又低，愛美想瘦的女性可適量食用，但避免空腹吃。其它如荔枝，

9、桔子，葡萄等都是富含檸檬酸的佳品。 白癲風患者不能服用含檸檬酸一類的酸的東西。,第二節(jié) 檸檬酸發(fā)酵原料 工業(yè)上考慮因素：經濟、技術、貨源、易得、易運、易貯、易管、不易霉變、可利用物質含量高、綜合利用價值高、無毒、無害、無抑制微生物生長的物質、對產品衛(wèi)生安全可靠、三廢負荷少。 1、糖類 薯類：甘薯、木薯、馬鈴薯、甘薯干、木薯干、馬鈴薯干、薯渣 谷類：玉米、小麥或小麥面粉、大米 淀粉：各種谷類、薯類等加工成的淀粉 砂糖：白砂糖、赤砂糖、糖蜜 淀粉糖：由淀粉水解得到的各種單糖、雙糖、糊精、飴糖、葡萄糖母液,2、正烷烴 液體石蠟：1020碳鏈的石油餾出物 3、其他 果實下腳料：葡萄、菠蘿、柑橘、蘋果等

10、果實加工的殘渣、殘汁 糧食加工下腳料,第三節(jié) 檸檬酸深層發(fā)酵工藝,為延長黑曲霉作用時間，采用二次發(fā)酵工藝 第一次固體發(fā)酵培養(yǎng)基接種黑曲霉（30靜止培養(yǎng)3d）第一次發(fā)酵 加適量麩皮、尿素及等量醬渣接種白地霉、酵母菌（30靜止培養(yǎng)）第二次發(fā)酵。,檸檬酸深層發(fā)酵工藝流程,深層發(fā)酵生產檸檬酸的主體設備是發(fā)酵罐。微生物在這個密閉容器內繁殖與發(fā)酵。現(xiàn)多采用通用發(fā)酵罐。 它的主要部件： 罐體、攪拌器、冷卻裝置、空氣分布裝置、消泡器，軸封及其他附屬裝置。 發(fā)酵罐徑高比例一般是1:2.5，應能承受一定的壓力,并有良好的密封性。,培養(yǎng)基制備： （1）種子罐培養(yǎng)基及培養(yǎng)：甘薯干粉1620%，(NH4)2SO40.5

11、%，0.1MPa蒸汽滅菌30min，接入1000ml三角瓶麩曲菌種，351培養(yǎng)1624小時，發(fā)酵罐的接種量為10%。 （2）發(fā)酵培養(yǎng)基：甘薯干粉1620%，0.1%中溫-淀粉酶115滅菌1015min，玉米粉采用高溫-淀粉酶二次噴射液化，液化后過濾除渣，應控制并調配其發(fā)酵培養(yǎng)基中蛋白質含量為0.20.4%,一、營養(yǎng)要求 根據(jù)檸檬酸發(fā)酵機制，黑曲霉能夠大量積累檸檬酸的條件，提供高濃度的葡萄糖和充足的氧，對磷、錳、鐵、鋅等無機鹽物質處于低水平。 1、碳源：葡萄糖、蔗糖、糊精 為了降低成本，工業(yè)上：甘薯、玉米、小麥及其淀粉、糖蜜等。 高糖濃度是檸檬酸發(fā)酵的一大特征：薯干粉的深層發(fā)酵，粉漿濃度16%2

12、0%，淀粉質深層發(fā)酵，粉漿濃度達25% 2、氮源（合成細胞質和調節(jié)代謝） 生理酸性氮 (NH4)2SO4, (NH4)3PO4, (NH4)2HPO4, NH4Cl, (NH4)2CO3等，調節(jié)代謝，控制pH 生理堿性氮 NaNO3, KNO3, LiNO3, Ca(NO3)2, Mg(NO3)2等 兩性氮 NH4NO3 有機氮 麩皮，米糠，蛋白胨，氨基酸，尿素等,玉米原料特點,1、玉米淀粉,2、玉米蛋白質,玉米粉的蛋白質含量較高，達9.3%，屬于醇溶朊、谷朊、球朊等。其中醇溶朊是玉米蛋白質的主要成分，它占玉米蛋白質總量的40%，加熱后凝固。玉米蛋白質對檸檬酸發(fā)酵具有雙重作用：一是節(jié)省檸檬酸發(fā)

13、酵所需氮源；二是與戊聚糖、色素等膠體雜質一起影響后道發(fā)酵及提取收率。因此，原料預處理過程中通過中和、過濾去除這部分雜質對檸檬酸生產的后道發(fā)酵、提取是必要的。,3、玉米中脂肪,3、無機鹽 在檸檬酸發(fā)酵中，無機鹽有的構成菌體，有的促進代謝，有的促進產酸，對黑曲霉的生長和檸檬酸發(fā)酵有重要作用,二、溫度控制 黑曲霉屬嗜熱微生物，最適生長溫度3337 37 菌體大量繁殖，糖被大量消耗以致產酸降低，同時還生成較多的草酸和葡萄糖酸 一般控制在（351） 孢子發(fā)芽和菌球體形成階段，可采用40 高溫培養(yǎng)，促進其發(fā)育 三、pH控制 適宜pH37。在發(fā)酵過程中，原料糖化和產酸過程在同一個環(huán)境中，發(fā)酵技術的關鍵是要保

14、證糖化速度和產酸速度之間的銜接與平衡。 黑曲霉檸檬酸生產菌的酸性糖化酶最適pH4.04.6 檸檬酸發(fā)酵最適pH2.0以下 解決辦法：采用酸性平板馴化，分離在高檸檬酸濃度下糖化酶活力高的菌株；通過調節(jié)風量來控制，在1618h前控制低風量，使pH維持在有利于菌株生長和糖化作用的范圍。,1、最適溫度的選擇 在生長階段，應選擇最適生長溫度； 在產物分泌階段，應選擇最適生產溫度。 發(fā)酵溫度可根據(jù)不同菌種、不同產品進行選擇 2、溫度的控制 工業(yè)生產上，所用的大發(fā)酵罐在發(fā)酵過程中一般不需要加熱，因發(fā)酵中釋放了大量的發(fā)酵熱，需要冷卻的情況較多。 利用自動控制或手動調整的閥門，將冷卻水通入發(fā)酵罐的夾層，通過熱交

15、換來降溫，保持恒溫發(fā)酵。 如果氣溫較高（特別是我國南方的夏季氣溫），冷卻水的溫度又高，致使冷卻效果很差，達不到預定的溫度，就可采用冷凍鹽水進行循環(huán)式降溫，以迅速降到最適溫度。因此大工廠需要建立冷凍站，提高冷卻能力，以保證在正常溫度下進行發(fā)酵。,二、 發(fā)酵溫度為351,三、pH值控制,（1）pH值對發(fā)酵的影響 影響酶的活性，當pH值抑制菌體中某些酶的活性時，會阻礙菌體的新陳代謝； 影響微生物細胞膜所帶電荷的狀態(tài)，改變細胞膜的通透性，影響微生物對營養(yǎng)物的吸收和代謝產物的排泄；影響培養(yǎng)基中某些組分的解離，進而影響微生物對這些成分的吸收； pH值不同，往往引起菌體代謝過程的不同，使代謝產物的質量和比例

16、發(fā)生改變。,（2）發(fā)酵過程pH值的變化 在發(fā)酵過程中，隨著菌種對培養(yǎng)基 碳、氮源的利用，隨著有機酸和氨基酸的積累，會使pH值產生一定的變化。 生長階段：菌體產生蛋白酶,水解培養(yǎng)基中的蛋白質，生成NH4+，使pH上升至堿性；隨著菌體量增多， NH4+的消耗也增多，另外糖利用過程中有機酸的積累使pH值下降。 生產階段：這個階段pH值趨于穩(wěn)定。 自溶階段：隨著養(yǎng)分的耗盡，菌體趨于自溶而代謝活動終止，菌體內活躍的蛋白酶和氨基氮進入培養(yǎng)液中，致使pH又上升。,pH值,培養(yǎng)時間,培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液pH值的大致變化趨勢,由此可見，在適合于菌生長及合成產物的環(huán)境條件下，菌體本身具有一定的調節(jié)pH的能力，但是當外

17、界條件變化過于劇烈，菌體就失去了調節(jié)能力，培養(yǎng)液的pH就會波動。,（3）引起發(fā)酵液pH值異常波動的因素 pH值的變化決定于所用的菌種、培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)條件 A)、pH下降： 培養(yǎng)基中碳、氮比例不當。碳源過多，特別是葡萄糖過量，或者中間補糖過多加上溶氧不足，致使有機酸大量積累而pH下降； 消泡劑加得過多； 生理酸性物質的存在，銨被利用，pH下降。 B)、pH上升： 培養(yǎng)基中碳、氮比例不當。氮源過多，氨基氮釋放，使pH上升； 生理堿性物質存在； 中間補料氨水或尿素等堿性物質加入過多。,（4）發(fā)酵pH值的確定和控制,發(fā)酵pH值的確定 微生物發(fā)酵的最適pH值范圍一般是在58之間。 最適pH值是根據(jù)實

18、驗結果來確定的。,將發(fā)酵培養(yǎng)基調節(jié)成不同的出發(fā)pH值，進行發(fā)酵，在發(fā)酵過程中，定時測定和調節(jié)pH值，以分別維持出發(fā)pH值，或者利用緩沖液來配制培養(yǎng)基來維持。 到時觀察菌體的生長情況，以菌體生長達到最高值的pH值為菌體生長的合適pH值。 用同樣的方法，可測得產物合成的合適pH值。 同一產品的合適pH值，與所用的菌種、培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件有關。 在確定合適發(fā)酵pH值時，要考慮培養(yǎng)溫度的影響，若溫度升高或降低，合適pH值也可能發(fā)生變動。,pH值的控制 首先考慮和試驗發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎配方，使碳源和氮源有個適當?shù)呐浔?，使發(fā)酵過程中的pH值變化在合適的范圍內。 在發(fā)酵過程中直接補加酸或堿和補料的方式來控制

19、；補充生理酸性物質（如(NH4)2SO4）和生理堿性物質（如NaNO3）來控制。,（5 ）檸檬酸發(fā)酵中開始pH自然5.5 隨著菌體生長pH降至2.22.3 隨著檸檬酸的大量生成pH迅速降至2.0以下。,四、接種量和接種方式 1、接種量 在一定范圍內，孢子接種量與產酸速率成正比，隨著孢子接種量的增加，檸檬酸產率也提高。 2、接種方式 在第一代生產種子液中，要用孢子接種（穩(wěn)定、生理年齡相同）。 在菌絲接種時，選擇對數(shù)生長期前期的菌絲體 五、溶解氧的控制 產酸速率與溶氧分壓成正比。 菌體生長中，有呼吸作用，在對數(shù)生長期需氧量達到最高峰 進入產酸期后，氧的消耗降低到一個較低的水平,溶解氧濃度的控制,在

20、供氧方面，主要是設法提高氧傳遞的推動力和液相體積氧傳遞系數(shù)。,調節(jié)攪拌轉速或通氣速率來控制供氧； 采用調節(jié)溫度（降低培養(yǎng)溫度可提高溶氧濃度）、液化培養(yǎng)基、中間補水、添加表面活性劑等工藝措施，來改善溶氧水平。,檸檬酸發(fā)酵通風控制,通風攪拌 是典型好氧發(fā)酵，對氧十分敏感，當發(fā)酵進入產酸期時只要有進幾分鐘的缺氧，就會對發(fā)酵造成嚴重影響，甚至完全失敗。,六、菌體濃度和基質對發(fā)酵的影響及其控制,1、菌體濃度對發(fā)酵的影響及控制,菌體（細胞）濃度【簡稱菌濃】是指單位體積培養(yǎng)液中菌體的含量。 菌濃的大小，在一定條件下，不僅反映菌體細胞的多少，而且反映菌體細胞生理特性不同的分化階段。,依靠調節(jié)培養(yǎng)基的濃度來控制

21、菌濃。,首先確定基礎培養(yǎng)基配方中的配比，避免產生過濃（或過稀）的菌體量。 然后通過中間補料來控制，如當菌體生長緩慢、菌濃太稀時，則可補加一部分磷酸鹽，促進生長，提高菌濃；但補加過多，則會使菌體過分生長，超過臨界濃度，對產物合成產生抑制作用。,利用菌體代謝產生的CO2量來控制生產過程的補糖量，以控制菌體的生長和濃度。,2、基質對發(fā)酵的影響及控制,基質即培養(yǎng)微生物的營養(yǎng)物質。,（1）. 碳源對發(fā)酵的影響及控制,迅速利用的碳源 緩慢利用的碳源,葡萄糖、蔗糖等 迅速參與代謝、合成菌體和產生能量，并產生分解產物，有利于菌體生長，但有的分解代謝產物對產物的合成可能產生阻遏作用；,多數(shù)為聚合物，淀粉等 為菌

22、體緩慢利用，有利于延長代謝產物的合成，特別有利于延長抗生素的分泌期，也有許多微生物的藥物發(fā)酵所采用。,在工業(yè)上，發(fā)酵培養(yǎng)基中常采用含迅速和緩慢利用的混合碳源。,（2）. 氮源對發(fā)酵的影響及控制,迅速利用的氮源 緩慢利用的氮源,氨基（或銨）態(tài)氮的氨基酸（或硫酸銨等）、玉米漿 容易被菌體利用，促進菌體生長，但對某些代謝產物的合成特別是某些抗生素的合成產生調節(jié)作用，影響產量。,延長代謝產物的分泌期、提高產物的產量；但一次投入也容易促進菌體生長和養(yǎng)分過早耗盡，以致菌體過早衰老而自溶，縮短產物的分泌期。,發(fā)酵培養(yǎng)基一般選用含有快速和慢速利用的混合氮源，還要在發(fā)酵過程中補加氮源來控制濃度。,補加有機氮源，

23、如酵母汁、玉米漿、尿素 補加無機氮源，如氨水或硫酸銨,（3）. 磷酸鹽對發(fā)酵的影響及控制,磷是微生物菌體生長繁殖所必需的成分，也是合成代謝產物所必需的。,微生物生長良好所允許的磷酸鹽濃度為0.32300mmol/L， 次級代謝產物合成良好所允許的最高平均濃度僅為1.0mmol/L.,檸檬酸發(fā)酵終點控制,當通風攪拌培養(yǎng)5072h 檸檬酸產酸達100150g/L，檸檬酸產量不再上升 殘?zhí)墙抵? g/L以下 可升溫終止發(fā)酵，泵送至儲罐中，及時進行提取。,3.1 薯干原料的發(fā)酵工藝,一、生產菌種 Co827、-130和-144、T419等 二、生產工藝條件 1、碳氮比 薯干蛋白質含量6%7%，不需要調

24、節(jié)含氮量 木薯干含蛋白質1.7%2.6%，需要用玉米粉、米糠、麩皮等有機氮源和適量無機氮源來補充 2、溫度 (371) 3、pH,4、控制生物量 廣義的生物量是生物在某一特定時刻單位空間的個體數(shù)、重量或其含能量 。 正常發(fā)酵液中控制在1020g/L；薯干粗糧發(fā)酵，因本身有大量粗纖維，生物量要達到22g/L 生物量過多影響溶氧、增加發(fā)酵罐攪拌功率、消耗大量葡萄糖。,5、嚴防缺氧 檸檬酸發(fā)酵是好氧發(fā)酵，對氧敏感。 產酸期只要有幾分鐘的缺氧時間就會造成發(fā)酵失敗。,6、孢子接種數(shù)與菌球體的特征 檸檬酸生成和菌體形態(tài)有密切關系，若發(fā)酵后期形成正常的菌球體，有利于降低發(fā)酵液粘度而增加溶解氧，因而產酸就高；若出現(xiàn)異狀菌絲體，而且菌體大量繁殖，造成溶解氧降低，使產酸迅速下降。,菌球體越小、越多，產酸就越高，發(fā)