mrna的分離純化細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)phage display_第1頁
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文檔簡介

1、噬菌體展示技術(shù)的原理及應(yīng)用(Key words: Phage display)1、噬菌體展示技術(shù)的原理2、噬菌體展示技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀3、噬菌體展示技術(shù)應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)4、展望一、噬菌體展示技術(shù)的原理基因型表達(dá)型融合蛋白PIIILeadHvLinkLvEPIII噬菌體展示技術(shù)是將各種多肽或蛋白質(zhì)以融合蛋白的形式表達(dá)并展示在噬菌體表面,同時(shí)將其遺傳包含于噬菌體內(nèi)部,這使得蛋白質(zhì)的功能與其基因起。有機(jī)的連結(jié)在一選擇方法:淘選(Panning)而不是篩選(Screening)非展示系統(tǒng)展示系統(tǒng)Solid phase selection with immunotubesImmunotubecoated w

2、ithcoated withsteptavidin andantigenbiotinylated antigenBBBBBBBSolution phase selection with biotinylated antigenantigenbiotinBind to Streptavidincoated microtitre wellsWash to remove unbound phage particles.Elute bound phageAmplify eluted phageRepeat selectionAnalyzea) ELISAb) Specificityc) Sequenc

3、ingd) Affinitye) Activity感染和擴(kuò)增E.coli固相完整細(xì)胞組織,器官淘選系統(tǒng)常規(guī)法正負(fù)法競爭法淘選方法噬菌體展示技術(shù)最關(guān)鍵的優(yōu)勢有三:第一,淘選的高效率使得在極低的存在水平下,挑選到高親和力噬菌體成為可能;第二,所挑選到的噬菌體可在微量存在的情況下,通過感染細(xì)菌得到富集;第三:展示的多肽或蛋白質(zhì)與其包含在噬菌體內(nèi)部的基因的連接,使得結(jié)合肽或蛋白質(zhì)的序列分析既快速又簡便。噬菌體(M13, T7, T4, l)病毒(反轉(zhuǎn)錄病毒,桿狀病毒) 細(xì)菌(葡萄球菌,E. Coli)酵母體外共價(jià)連接(蛋白DNA,蛋白RNA)表面展示系統(tǒng)應(yīng)用范圍:診斷被動免疫蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析藥物導(dǎo)航蛋白

4、質(zhì)純化抗體受體配體信息傳遞詰抗劑抑制劑蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)DNA 蛋白質(zhì)其他診斷基因表達(dá)控制中和活力藥物及藥物導(dǎo)航酶及底物多肽噬菌體抗體庫的構(gòu)建Antibody IgG structureAntibody IgG structureAntibody IgG structureCLVLCLVL1CV1VCHHHHCH2CH3CH2CH3Antibody IgG structureVLCLFabVH(Fab)2CH1HingeCH2FcCH3Membrane ExtensionAntibody IgG structureVLCLVHCH1CH2CH3VLFvCLVHCH1CH2CH3VLVLscFv

5、FvVHVHSingle Chain Fragment variable單克隆抗體雜交瘤技術(shù)雜交瘤103幾個(gè)月繁雜必須- 高 有限再克隆有限噬菌體抗體展示技術(shù)細(xì)菌107-109幾周相對簡單可避免+低 無限直接不可估宿主細(xì)胞:篩選范圍:時(shí)間:操作:免疫:人源抗體: 費(fèi)用:生產(chǎn)量: 基因獲取:應(yīng)用前景:二、噬菌體展示技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀1. 抗體:抗狂犬病毒的單鏈抗體, 抗HIV-1囊膜糖蛋白的單鏈抗體,此抗體可專一性殺死被HIV-1感染并表達(dá)有g(shù)p120的淋巴細(xì)胞, 中和響尾蛇毒素的單鏈抗, 等等。2. 疫苗:展示在噬菌體表面的HIV-1 的gp120-V3 環(huán) 可象天然抗原一樣引起顯著的免疫應(yīng)答,

6、等等。3.多肽類藥物:如一些激動劑或拮抗劑從多肽庫中分離鑒定出來;已獲得一13 肽,它能中和蛇毒 -bungarotoxin;從CX7C 多肽庫中掏選到一個(gè)多肽能與 Hantavirus 結(jié)合, 并使該病毒不能結(jié)合或感染細(xì)胞。人血管促生素(angiogenin)是一種能促進(jìn)腫瘤血管生長的蛋白,用這個(gè)蛋白去淘選一個(gè)噬菌體展示多肽庫,所獲得的一個(gè)環(huán)狀8肽能與血管促生素結(jié)合,并能阻遏血管促生素的活性;等等。4.腫瘤藥物導(dǎo)航載體:用腫瘤細(xì)胞特殊的受體蛋白從展示文庫中淘選到的多肽或單鏈抗體,可以作為抗癌藥物的定向輸送工具 。一個(gè)成功的實(shí)例是:將噬菌體多肽展示庫注射入具有腫瘤的小鼠體內(nèi),然后殺死小鼠,取出

7、腫瘤,再將結(jié)合其上的噬菌體洗脫下來。展示在其上的多肽具有與該腫瘤的特異性親和力。將此多肽與細(xì)胞毒素doxorubicin 偶聯(lián)。結(jié)果顯示,此偶聯(lián)物具有更強(qiáng)的抑制腫瘤的效果.5.酶:例:堿性磷酸酶,蛋白水解酶類,等等6. 底物與抑制劑:主要是蛋白酶的底物和其抑制劑。7.信息傳遞研究:利用噬菌體展示多肽庫,發(fā)現(xiàn)了一些受體, 如凝血致活酶、黑皮質(zhì)素受體、CD80 和一個(gè) Hantaviral 受體;受體的配體, 如血管促生素、 -bungarotoxin, 和一些大蛋白分子SH2、SH3 和WW 區(qū)域。中的折疊區(qū)域,如從多肽庫中可分離到與天然激素相似的、與受體結(jié)合的高親和力的多肽, 因此用完整細(xì)胞可

8、以從多肽庫中找到受體的高選擇性配體。在不知道任何有關(guān)的受體和配體信息的情況下,用完整細(xì)胞和組織或動物,可篩選到特異與靶組織結(jié)合的多肽和蛋白。8. DNA結(jié)合蛋白:鋅指蛋白是一類 DNA 結(jié)合小肽結(jié)構(gòu)物,這些結(jié)構(gòu)含有鋅,能用于構(gòu)建一個(gè)大的蛋白區(qū)域,去識別和結(jié)合特殊的 DNA 序列。噬菌體展示技術(shù)也可以用于創(chuàng)造一個(gè)大的、具有識別不同 DNA 序列的 鋅指的多肽庫。利用這個(gè)多肽庫,可以研究有關(guān)氨基酸序列與DNA 結(jié)合位點(diǎn)之間的識別規(guī)則,可以通過設(shè)計(jì) 鋅指多肽去控制基因的表達(dá),比如抑制小鼠細(xì)胞系中的癌基因,也可以啟動表達(dá)質(zhì)粒的基因,或干擾病毒感染生活周期。1 9. 蛋白質(zhì)組學(xué):噬菌體展示技術(shù)作為一個(gè)多

9、肽和蛋白質(zhì)合成的工具箱,使得任何蛋白均能找到與其有特異結(jié)合力的多肽和蛋白質(zhì),其構(gòu)建的文庫的滴度可達(dá)1012。蛋白質(zhì)組學(xué)的基本點(diǎn)就是利用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用,對成千上萬種蛋白質(zhì)同時(shí)進(jìn)行分析。而噬菌體展示技術(shù)正好能符合這種要求。例:將噬菌體展示cDNA 文庫制成蛋白點(diǎn)陣,成功的應(yīng)用于尋找與過敏癥有關(guān)的蛋白質(zhì)。三、噬菌體展示技術(shù)應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)*疾病的發(fā)生給我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。而疾病防治技術(shù)的開發(fā)仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足漁業(yè)發(fā)展的要求。*我國水產(chǎn)病害的防治目前主要以抗生素及各種消毒化學(xué)品為主。*尋找新的病害防治途徑。5.展望 九十年代末,生物技術(shù)、基因和蛋白質(zhì)、生物信息和分子文庫系統(tǒng)的發(fā)展

10、,大大促進(jìn)了新藥發(fā)現(xiàn)的技術(shù)革命,其中噬菌體展示技術(shù)表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)越性,由此而發(fā)展出的一些新方法更是大大的擴(kuò)展了新藥的發(fā)現(xiàn)和利用范圍。隨著噬菌體展示技術(shù)在尋找新藥道路上的不斷成功,這種方法不僅限于人類醫(yī)藥的發(fā)現(xiàn),也可以用于植物病蟲害的防治,畜牧業(yè)病害的防治以及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)病害的防治,特別是在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中,可避免抗生素和化學(xué)藥品,防止水體進(jìn)一步地污染。 很明顯,噬菌體展示技術(shù)作為一個(gè)多肽和蛋白合成的工具箱,使得任何蛋白均能找到與其有特異結(jié)合力的多肽和蛋白,這將極大地促進(jìn)生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究,因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與其它分子的結(jié)合和相互作用是生命現(xiàn)象的主要過程。隨著該技術(shù)的不斷發(fā)展和創(chuàng)新,所獲得的信息越來越多,如果能與生物芯片技術(shù)以及生物信息技術(shù)結(jié)合起來,其應(yīng)用范圍和能力將會得到更大的發(fā)展。結(jié)合水生所的發(fā)展方向,我認(rèn)為噬菌體展示技術(shù)可以作

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