分子生物學(xué)第四章

1、第四章 分子生物學(xué)的研究方法,一、重組DNA技術(shù),理論上三大發(fā)現(xiàn) 技術(shù)上三大發(fā)明,遺傳物質(zhì)是DNA DNA雙螺旋結(jié)構(gòu) 遺傳信息傳遞方式,工具酶 載體 轉(zhuǎn)錄酶,1973年 以DNA重組實驗成功為標(biāo)志,現(xiàn)代分子生物學(xué),跨越天然物種屏障 定向創(chuàng)造新物種,工具酶 基因 載體 受體細(xì)胞,必要條件,操作過程 獲得外源基因（目的基因/目的片段） 與載體進(jìn)行體外重組形成重組體（重組子） 將重組體導(dǎo)入（轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)染）受體細(xì)胞 細(xì)胞擴增和篩選含有重組體的受體細(xì)胞（宿主細(xì)胞/寄主細(xì)胞） 培養(yǎng)含有重組體的細(xì)胞（陽性克?。z測表達(dá)產(chǎn)物,分、 切、 接、 轉(zhuǎn)、 篩 + 檢,工具酶,限制性內(nèi)切酶,連接酶,修飾酶,DNA

2、聚合酶 DNA Polymerase,逆轉(zhuǎn)錄酶 Reverse Transcriptase,T4多核苷酸酶 T4 Polymerase Kinase,堿性磷酸酶 Alkalinephosphatase,活性定義 限制酶的一個活性單位（1U），原則上是在50l的反應(yīng)液中，37的溫度條件下，經(jīng)過1小時反應(yīng)，將1gDNA完全分解所需要的酶量。,特點 識別部位序列一般為4、5或6個核苷酸序列； 呈雙重軸對稱。,限制性內(nèi)切酶,性質(zhì) 切斷識別部位或其附近特定部位后，產(chǎn)生兩種末端，即平齊末端和粘性末端（5突出端和3突出端）。,Pst I,CTGCAG GACGTC,EcoR I,3突出,5突出,特殊的限制酶

3、 同裂酶isoschizomer 指來源不同，但有相同識別序列的限制性內(nèi)切酶。 同尾酶isocaudamer 指識別序列不同，但切割DNA后可以產(chǎn)生相同粘端的限制性內(nèi)切酶。,DNA連接酶可以催化單鏈DNA的連接嗎？ DNA連接酶可以催化缺少核苷酸的切口的連接嗎？,連接酶,主要連接酶的功能特點,載體和插入片段具有相同的粘性末端 容易連接成環(huán)狀的重組DNA分子 可能出現(xiàn)問題： 載體自身環(huán)化，造成假陽性背景克??； 插入片段可雙向插入； 插入片段可多拷貝插入。 當(dāng)DNA片段兩端為非同源的粘性末端 可實現(xiàn)定向克隆，連接效率高，簡捷,粘性末端連接,可在連接前，用堿性磷酸酶將載體DNA5端去磷酸化，這樣只有

4、載體和插入片段之間才能發(fā)生連接；,利用磷酸酶防止載體DNA的重新環(huán)化,。,質(zhì)粒載體的定向克隆,E.coli. DNA聚合酶I E.coli. DNA聚合酶I大片段 （Klenow fragment） T4噬菌體DNA聚合酶 T7噬菌體DNA聚合酶 耐高溫DNA聚合酶： Taq DNA聚合酶,DNA Polymerase,Reverse Transcriptase,Alkalinephosphatase,T4 Polymerase Kinase,細(xì)菌堿性磷酸酶BAP 牛小腸堿性磷酸酶CIP,修飾酶,載體(vector)是能夠攜帶外源DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴增和表達(dá)的DNA,它們一般是通過改造質(zhì)粒

5、、噬菌體或病毒等構(gòu)建而成的。,載 體,質(zhì)粒,噬菌體,病毒,組合載體,種 類,能在宿主細(xì)胞中獨立復(fù)制; 具有多種限制酶的單一切點（多克隆位點）以便外源DNA插入； 具有篩選標(biāo)記,以區(qū)別陽性與陰性重組分子; 分子較小，便于體外基因操作，同時載體DNA與宿主DNA便于分離； 表達(dá)載體:具有與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動子、增強子、加尾信號等基因表達(dá)元件。,必要條件,具備條件,分類,克隆載體：以繁殖DNA為目的的載體，通常分子較小，自我復(fù)制能力強，拷貝數(shù)高。如pBR322、pUC、M13等。,穿梭載體：帶有兩種復(fù)制原點，在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中都能繁殖的載體，通常用于真核基因的克隆。,表達(dá)載體：以獲得基因表達(dá)產(chǎn)

6、物為目的的載體，通常要具有強啟動子、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、拷貝數(shù)高和能在宿主細(xì)胞中高效表達(dá)等特點。,克隆載體的特性 復(fù)制起始：在受體細(xì)胞中獨立復(fù)制 多克隆位點：含多個限制性核酸內(nèi)切酶單一切點 多選擇標(biāo)記：抗藥性，其他遺傳標(biāo)記 分子量?。耗苋菁{的外源DNA片段盡可能大,常用克隆載體 質(zhì)粒 噬菌體 Cosmid Phagemid 真核病毒 YAC, BAC,分類,松弛型*獨立復(fù)制，拷貝數(shù)高, 10-200個拷貝/細(xì)胞，例如pUC載體可達(dá)700個/細(xì)胞 嚴(yán)緊型受受體染色體DNA復(fù)制控制，拷貝數(shù)低，1-幾個拷貝/細(xì)胞，例如pSC101,天然型 人工型*,可轉(zhuǎn)移型 不可轉(zhuǎn)移型*,氯霉素擴增氯霉素可抑制染色體DNA復(fù)制，但質(zhì)粒復(fù)制不受影響，