GB 5009.89-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中煙酸和煙酰胺的測(cè)定

016 前 言本標(biāo)準(zhǔn)代替003食品中煙酸的測(cè)定、010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品種煙酸和煙酰胺的測(cè)定和008肉與肉制品維生素010相比,主要變化如下:標(biāo)準(zhǔn)名稱修改為“食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中煙酸和煙酰胺的測(cè)定”;調(diào)整了試劑順序和格式;修改并細(xì)化了適用于不同食品種類的前處理方法(第一法);增加了標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度校正方法(第二法);重新評(píng)估了檢出限,增加了定量限。0161 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中煙酸和煙酰胺的測(cè)定1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中煙酸和煙酰胺的測(cè)定方法。本標(biāo)準(zhǔn)第一法為微生物法,適用于各類食品包括以天然食品為基質(zhì)的強(qiáng)化食品中煙酸和煙酰胺總量的測(cè)定;第二法為高效液相色譜法,適用于強(qiáng)化食品中煙酸和煙酰胺的測(cè)定。第一法 微生物法2 原理煙酸(煙酰胺)是植物乳桿菌長所必需的營養(yǎng)素,在一定控制條件下,利用植物乳桿菌對(duì)煙酸和煙酰胺的特異性,在含有煙酸和煙酰胺的樣品中生長形成的光密度來測(cè)定煙酸和煙酰胺的含量。3 試劑和材料除非另有說明,本方法所用試劑均為分析純,水為6682規(guī)定的二級(jí)水。培養(yǎng)基可購買符合測(cè)試要求的商品化培養(yǎng)基。種植物乳桿菌或其他有效標(biāo)準(zhǔn)菌株。酸(氧化鈉(化鈉(硫酸(醇(酸溶液(1):吸取831000917勻。酸溶液():吸取鹽酸溶液(0水溶解至100 氫氧化鈉溶液(1):稱取40水溶解并稀釋至1000勻。0162 氧化鈉溶液():吸取氫氧化鈉溶液(0水溶解至100 生理鹽水(:稱取9解于1000裝1021滅菌15用。醇溶液(25%):量取200 硫酸溶液(1):于2000取56水稀釋到1000酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基: 乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基: 煙酸測(cè)定用培養(yǎng)基:一些商品化合成培養(yǎng)基效果良好,商品化合成培養(yǎng)基按標(biāo)簽說明進(jìn)行配制。準(zhǔn)品煙酸(純度或經(jīng)國家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(乙醇溶液溶解并移至500容,混勻于24冷藏。此溶液每毫升相當(dāng)于100 煙酸標(biāo)準(zhǔn)中間液(1g/)置于100乙醇溶液稀釋并定容至刻度,混勻于24冷藏。此溶液每毫升相當(dāng)于1 煙酸標(biāo)準(zhǔn)工作液(100ng/)置于50水稀釋定容至刻度,混勻于24冷藏。此溶液每毫升相當(dāng)于100 平:質(zhì)設(shè)備:用于試樣的均質(zhì)化。溫培養(yǎng)箱:361。旋振蕩器。力蒸汽消毒器:121(心機(jī):轉(zhuǎn)速2000r/.7 度光光度計(jì)。凈工作臺(tái)。聲波振蕩器。注:玻璃儀器使用前,用活性劑(月桂磺酸鈉或家用洗滌劑加入到洗滌用水中即可)對(duì)硬玻璃測(cè)定管及其他必要的玻璃器皿進(jìn)行清洗,清洗之后烘干,于170干熱3 0163 備菌種的制備將菌種植物乳桿菌接至乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基中,在361恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h24h,取出后放入24冰箱中保存。每月至少傳種一次,作為儲(chǔ)備菌株保存。實(shí)驗(yàn)前將儲(chǔ)備菌株接種至乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基中,在361恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h24于接種液的制備。保存數(shù)周以上的儲(chǔ)備菌種,不能立即用作接種液制備,實(shí)驗(yàn)前宜連續(xù)傳種2代3代以保證菌株活力。種液的制備試驗(yàn)前一天,從乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基移取部分菌種于滅菌的10361恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h18h。在無菌條件下離心該培養(yǎng)液15去上清液。加入10旋渦混合器上快速混合均勻,離心15去上清液。重復(fù)離心和清洗步驟三次。以第三次細(xì)胞分散液中吸取1其充分混合均勻制成混懸液,備用。用721分光光度計(jì),在550理鹽水為參比,讀取該菌懸液的透光值,理鹽水或第三次細(xì)胞分散液調(diào)整透光值,使其范圍在60%80%之間。立即使用。樣制備谷薯類、豆類、堅(jiān)果(去殼)等試樣需粉碎、研磨、過篩(乳粉、米粉等試樣混勻;肉、蛋、魚、動(dòng)物內(nèi)臟等用打碎機(jī)制成食糜;果蔬、半固體食品等試樣需勻漿混勻;液體試樣用前振搖混合。如不能馬上檢測(cè),于4冰箱保存。樣提取準(zhǔn)確稱取約煙酸試樣,一般乳類、新鮮果蔬試樣2g5g(谷類、豆類、堅(jiān)果類、內(nèi)臟、生肉、g(液態(tài)試樣5g;乳粉、米粉等準(zhǔn)確稱取適量試樣2g(一般營養(yǎng)素補(bǔ)充劑、g;液體飲料或流質(zhì)、半流質(zhì)試樣5g10入被檢驗(yàn)物質(zhì)干重10倍的硫酸溶液。在121下,水解30水定容至100無灰濾紙過濾,濾液備用。釋根據(jù)試樣中煙酸含量用水對(duì)試樣提取液進(jìn)行適當(dāng)稀釋(f),0000500050000000表1?；靹颉Ｃ總€(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)應(yīng)制備3管。0164 表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線管的制作試管號(hào)(12345678910蒸餾水/中不添加標(biāo)準(zhǔn)溶液;2中滴加菌液;0中添加標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度依次增高。3個(gè)重復(fù)。樣系列管取4支試管,表2?；靹?每個(gè)濃度做3個(gè)重復(fù)。表2 試樣管的制作試管號(hào)(1234蒸餾水/菌將所有的標(biāo)準(zhǔn)系列管和試樣系列管測(cè)定管塞好棉塞,于121(壓滅菌5菌完成后,迅速冷卻,備用。種:在無菌操作條件下,將接種液轉(zhuǎn)入無菌滴管,向每支測(cè)定管接種一滴。養(yǎng):將加完菌液的試管置于361恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h24h,直至獲得最大濁度,即再培養(yǎng)2準(zhǔn)備一支標(biāo)準(zhǔn)0管(接種作為0對(duì)照管。定用厚度為1波長550培養(yǎng)好的測(cè)定管用渦旋混勻器混勻。以未接種0對(duì)照管調(diào)節(jié)透光率為100%,然后依次測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列管、試樣系列管的透光率。取出最高濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線管振蕩5s,測(cè)定光密度值,放回重新培養(yǎng)。2果兩次光密度的絕對(duì)差結(jié)果2%,則取出全部檢驗(yàn)管測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣的光密度。準(zhǔn)曲線的制作以標(biāo)準(zhǔn)系列管煙酸含量為橫坐標(biāo),光密度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,也可對(duì)各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)做擬合曲線。各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)3管之間的光密度值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)小于10%,如果某一標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)3支試樣管中有2支煙酸含量落在5000該兩管之間折合為每毫升試樣提取液中煙酸含量的偏差小于10%,則該結(jié)果可用,如果3支試樣管中煙酸含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差大于10%,則該點(diǎn)舍去,不參與標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。0165 6 分析結(jié)果的表述試樣結(jié)果計(jì)算:從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得試樣系列管中煙酸的相應(yīng)含量(c),按式(1)進(jìn)行結(jié)果計(jì)算。測(cè)定液濃度按式(1)計(jì)算:X=V1001000(1)式中: X 試樣中煙酸含量,單位為毫克每百克(00g);試樣系列管折合為試樣提取液中煙酸濃度平均值,單位為納克每毫升(ng/試樣提取液定容體積,單位為毫升(f試樣提取液稀釋倍數(shù);m試樣質(zhì)量,單位為克(g);1001000折算成每百克試樣中煙酸毫克數(shù)的換算系數(shù)。結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。7 精密度普通食品在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的15%;強(qiáng)化食品在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的5%。8 其他按樣品種類將待測(cè)試樣稀釋到線性范圍內(nèi)再對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)試。本標(biāo)準(zhǔn)試管法線性范圍50ng/00ng/然類等含量較低的食品試樣稱樣量為500g,00g;強(qiáng)化食品等含量較高的食品試樣稱樣量為100g,00g。第二法 高效液相色譜法9 原理高蛋白樣品經(jīng)沉淀蛋白質(zhì),高淀粉樣品經(jīng)淀粉酶酶解,在弱酸性環(huán)境下超聲波振蕩提取,以紫外檢測(cè)器檢測(cè)261據(jù)色譜峰的保留時(shí)間定性,外標(biāo)法定量,計(jì)算試樣中煙酸和煙酰胺含量。10 試劑和材料除非另有說明,本方法所用試劑均為分析純,水為6682規(guī)定的一級(jí)水。酸(優(yōu)級(jí)純。0166 氧化鈉(優(yōu)級(jí)純。氯酸(體積分?jǐn)?shù)為60%,優(yōu)級(jí)純。醇(色譜純。丙醇(色譜純。烷磺酸鈉(色譜純。粉酶:酶活力酸():用量筒量取4151000585勻。酸():1000勻。氧化鈉():稱取200)于燒杯中加水溶解并轉(zhuǎn)移至1000水定容,混勻。氧化鈉():)于燒杯中加水溶解并轉(zhuǎn)移至1000水定容,混勻。動(dòng)相:甲醇70丙醇20烷磺酸鈉1g,用910酸和煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液煙酸(煙酰胺(純度99%,或經(jīng)國家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。酸和煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(分別置于100鹽酸溶解,定容至刻度,混勻(4冰箱中可保存1個(gè)月)。注:標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制完以后,需要進(jìn)行濃度校正,校正方法見附錄B。酸和煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)混合中間液(準(zhǔn)確吸取煙酸和煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(水定容至刻度,混勻。臨用前配制。酸和煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)混合工作液:分別準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)混合中間液(水定容至刻度,混勻,用前配制。11 平:箱培養(yǎng)箱:3080。聲波振蕩器。11.4 度效液相色譜儀:帶紫外檢測(cè)器。次性微孔濾頭:2 樣制備與處理非粉狀固態(tài)試樣粉碎并混合均勻;液態(tài)試樣搖勻。0167 粉類和含淀粉的食品(即食谷物、面包、餅干、面條、小麥粉和雜糧粉等制品)加入約2550的水,150勻后向錐形瓶中充氮,蓋上塞,置于5060的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)約30出冷卻至室溫。注:如果條件允許,建議酶解時(shí)采用555水浴振搖。含淀粉的食品(調(diào)制乳、調(diào)制乳粉、飲料類、固體飲料類、豆粉和豆?jié){粉等制品)加入約2550的水,150于超聲波振蕩器中振蕩約10置50冷卻至室溫。取待試樣溶液降至室溫后,置約2于50水浴超聲波振蕩器中振蕩10卻至室溫后轉(zhuǎn)至100水反復(fù)沖洗錐形瓶,洗液合并于100水定容至刻度后混勻,經(jīng)濾紙過濾。樣品瓶收集,即為試樣測(cè)定液。注:必要時(shí),試樣測(cè)定液用水進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂?f),使試樣測(cè)定液中煙酸和煙酰胺濃度在1g/0g/考液相色譜條件參考液相色譜條件列出如下:a) 色譜柱:徑5m,250具有同等性能的色譜柱;b) 柱溫:25c) 紫外檢測(cè)器:檢測(cè)波長為261nm;d) 流動(dòng)相:甲醇70丙醇20烷磺酸鈉1g,用910e) 流速:f) 進(jìn)樣量:10準(zhǔn)曲線測(cè)定按照已經(jīng)確立的色譜條件,將煙酸及煙酰胺混合標(biāo)準(zhǔn)系列測(cè)定液依次按上述推薦色譜條件進(jìn)行測(cè)定(記錄各組分的色譜峰面積或峰高,以峰面積或峰高為縱坐標(biāo),以標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定液的濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣溶液的測(cè)定將試樣測(cè)定液按上述推薦色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。記錄各組分色譜峰面積或峰高,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出試樣測(cè)定液中煙酸及煙酰胺各組分的濃度。0168 13 樣煙酸和煙酰胺含量計(jì)算試樣中煙酸或煙酰胺的含量,按式(2)計(jì)算:iV100m(2)式中:試樣中煙酸或煙酰胺的含量,單位為微克每百克(g/100g);試樣待測(cè)液中煙酸或煙酰胺的濃度,單位為微克每毫升(g/V試樣溶液的體積,單位為毫升(m試樣的質(zhì)量,單位為克(g)。注:液態(tài)試樣中煙酸或煙酰胺含量也可以微克每百毫升(g/100單位。樣中維生素式(3)計(jì)算:X=2(3)式中:X 試樣中維生素位為微克每百克(g/100g);試樣中煙酸的含量,單位為微克每百克(g/100g);試樣中煙酰胺的含量,單位為微克每百克(g/100g);煙酰胺轉(zhuǎn)化成煙酸的系數(shù)。果表述結(jié)果保留到整數(shù)。14 精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的10%。15 其他當(dāng)稱樣量為5酸檢出限為30g/100g,定量限為100g/100g,煙酰胺檢出限為40g/100g,定量限為120g/100g。0169 附 錄 法先將除瓊脂以外的其他成分溶解于蒸餾水中,025),再加入瓊脂,加熱煮沸,使瓊脂融化?；旌暇鶆蚝蠓盅b試管,每管1021高壓滅菌15用。法將上述成分溶解于水中,025),分裝1021高壓滅菌15用。01610 行配