科技獎(jiǎng)勵(lì)申報(bào)禽流感動(dòng)物模型免疫機(jī)理及疫苗研制與推廣應(yīng)用ppt課件

肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司,廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所,廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司,2011年11月,禽流感動(dòng)物模型、免疫機(jī)理及疫苗研制與推廣應(yīng)用,立項(xiàng)背景,總體思路,主要技術(shù)內(nèi)容,主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn),匯 報(bào) 提 綱,五,六,三,二,一,四,七,相關(guān)知識(shí)產(chǎn)權(quán)與獲獎(jiǎng)勵(lì)情況,主要技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo)與推廣效益,主要完成人對(duì)項(xiàng)目的貢獻(xiàn),禽流感的危害,經(jīng)濟(jì)損失巨大,危害人類健康,影響國家形象 和社會(huì)穩(wěn)定,2005年11月8日，溫家寶在黑山防治高致病性禽流感醫(yī)療站看望醫(yī)療、防疫人員。,一 立項(xiàng)背景（1）,迄今為止，全世界已有超過 4億只家禽染病死亡或慘遭撲殺，造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)200 億美元,我國2004年、05年、06年大規(guī)模爆發(fā)禽流感，養(yǎng)禽業(yè)損失150億美元以上,世界衛(wèi)生組織（）發(fā)出警告，一場(chǎng)全球性的流感大流行將會(huì)導(dǎo)致200萬700萬人命喪黃泉,人們心理恐慌，不敢吃雞，家禽業(yè)受損，出口受阻，旅游業(yè)受挫，行業(yè)經(jīng)濟(jì)全面受到?jīng)_擊，影響社會(huì)穩(wěn)定,糧農(nóng)組織的資料顯示，H5N1高致病性禽流感疫情于2003年爆發(fā)后，在全球己感染565人，導(dǎo)致331人死亡。,今年9月，聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)官員盧布羅夫日前發(fā)出警告，一種致命的“H5N1”高致病性禽流感變種病毒在越南出現(xiàn)?，F(xiàn)有的所有疫苗對(duì)該病毒均無效果。,1、我國地域遼闊，候鳥的遷簁致使禽流感長期存在，加劇防疫的難度。 2、禽流感毒株變異快，對(duì)疫苗防控技術(shù)提出新的挑戰(zhàn)。 3、動(dòng)物禽流感疫苗生產(chǎn)工藝落后，標(biāo)準(zhǔn)化水平低，亟待改進(jìn)。 4、研究人禽流感疫苗和藥物缺乏哺乳動(dòng)物模型，有待摸清和建立哺乳動(dòng)物的免疫機(jī)理。,針對(duì)以上問題，進(jìn)行了“禽流感動(dòng)物模型、免疫機(jī)理及疫苗的研究”,肌肉變綠,一 立項(xiàng)背景（2）,禽流感防治存在的問題,二 總體思路,1、通過蛋白重組技術(shù)，建立禽流感疫苗產(chǎn)業(yè)化的基礎(chǔ)種毒和疫苗毒株，研制高致病性多變異型的高效疫苗，用于動(dòng)物禽流感的防控。 2、利用造模毒株建立哺乳動(dòng)物模型,為人禽流感疫苗和藥物研究提供技術(shù)支持。 3、研究新的生產(chǎn)工藝，制定新的標(biāo)準(zhǔn)，為禽流感疫苗產(chǎn)業(yè)化提供檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)和制造標(biāo)準(zhǔn)。,三 主要技術(shù)內(nèi)容,三 主要技術(shù)內(nèi)容（1）,1、制備禽流感毒株,篩選造模毒株,確定鵝源禽流感H5N1病毒(A/Goose/Guangdong/NH/2003)是適宜的毒株，不必經(jīng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞適應(yīng)，利用雞胚內(nèi)擴(kuò)增病毒后即可感染哺乳類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，并在體內(nèi)增殖，表現(xiàn)出與人禽流感相似的臨床病癥。,篩選疫苗毒株,最終選取H5N1（Re-1/4/5）、H9（SS）和(SS/94)作為制備疫苗毒株，這些毒株毒力弱、免疫原性好，能突破母源抗體干擾，生產(chǎn)種毒各項(xiàng)性能指標(biāo)領(lǐng)先。,三 主要技術(shù)內(nèi)容（2）,2、研究建立哺乳動(dòng)物模型及模型指標(biāo),（1） 利用造模毒株建立了近交系BALB/c小鼠和封閉群ICR小鼠兩個(gè)小鼠模型。確定了近交系BALB/c小鼠和封閉群ICR小鼠的接種劑量100uL ，可使感染小鼠死亡率達(dá)到73%；通過不同接種途徑的研究，確定鼻腔接種后感染小鼠出現(xiàn)明顯的禽流感臨床疾病過程。,同時(shí)確定了小鼠模型的臨床癥狀、死亡率、病理變化、病毒復(fù)制、免疫反應(yīng)等方面指標(biāo)要符合人類感染禽流感疾病的基本特征,（2） 確定用“環(huán)甲膜穿刺術(shù)”經(jīng)氣管接種為猴呼吸道接種方式，建立了恒河猴模型。該方法可以將接種物直接接種到肺內(nèi)，操作技術(shù)簡(jiǎn)單，定量準(zhǔn)確，動(dòng)物損傷較小，不需較高防護(hù)設(shè)備。,同時(shí)確定了恒河猴模型的臨床癥狀、體溫、呼吸頻率、感染器官、抗體水平、外周血白細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化、外周血T 淋巴細(xì)胞及其亞群的動(dòng)態(tài)變化、免疫因子、病理變化方面的指標(biāo)，要與人禽流感疾病相似。,三 主要技術(shù)內(nèi)容（3）,3、研究禽流感免疫機(jī)理,小鼠模型免疫機(jī)理,（1）主要表現(xiàn)T細(xì)胞免疫功能損傷，這種損傷與感染病程的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸相一致，細(xì)胞免疫功能指標(biāo)下降時(shí)期也是病情嚴(yán)重時(shí)期。到達(dá)恢復(fù)期各指標(biāo)漸恢復(fù)正常。T細(xì)胞免疫功能低下是免疫病理改變之一。 （2）細(xì)胞因子表達(dá)失去平衡或過多的表達(dá)，都可能對(duì)宿主產(chǎn)生免疫病理損傷，推測(cè)這是H5N1禽流感引起哺乳動(dòng)物嚴(yán)重疾病的另一重要致病機(jī)制。,恒河猴模型免疫機(jī)理,主要表現(xiàn)為外周血淋巴細(xì)胞數(shù)和一些T淋巴細(xì)胞亞群在第1天出現(xiàn)一過性下降，T 淋巴細(xì)胞亞群CD3T淋巴細(xì)胞、CD3CD4+T淋巴細(xì)胞和CD3CD8+T 淋巴細(xì)胞也在感染的第1 天出現(xiàn)一過性的下降，感染后第7天出現(xiàn)抗體，并逐漸升高，11天后達(dá)到最高，至90天仍維持較高水平?？笻5N1抗體能有效保護(hù)并減輕病毒對(duì)機(jī)體的再次攻擊，抑制病毒增殖，為人禽流感疾病的免疫接種或抗體治療提供了直接依據(jù)。,三 主要技術(shù)內(nèi)容（4）,4、研制禽流感系列疫苗,建立生產(chǎn)種子庫,研究質(zhì)量控制關(guān)鍵點(diǎn),將基礎(chǔ)毒種經(jīng)SPF雞胚復(fù)壯、增殖與傳代，建立種子批，經(jīng)病毒含量、血凝特性、毒力、安全性、免疫原性、特異性、純粹檢驗(yàn)等試驗(yàn)檢驗(yàn)均符合要求。同時(shí)，定期對(duì)不同代次的基礎(chǔ)種毒和生產(chǎn)用種毒對(duì)免疫原性相關(guān)基因HA和NA進(jìn)行測(cè)序并分析其序列是否變異，以確保種毒不發(fā)生變異。,（1）確定多聯(lián)疫苗的質(zhì)量控制關(guān)鍵點(diǎn)為“抗原濃縮”和“乳化”技術(shù)； （2）通過比較Millipore的橫向切流、中空纖維、連續(xù)離心等進(jìn)行濃縮抗原的方法，最終確定了抗原濃縮（23倍）是免疫保護(hù)效果與單苗一致的關(guān)鍵工藝。 （3）研究不同乳化設(shè)備對(duì)乳化效果的影響，最終確定選擇了進(jìn)口乳化設(shè)備是最佳乳化工藝的關(guān)鍵。按照該工藝生產(chǎn)的疫苗，乳化顆粒均勻，穩(wěn)定性好，疫苗中抗原釋放速度合理。該種疫苗在2-8的保存期超過15個(gè)月，疫苗免疫雞后持續(xù)期超過5個(gè)月。,在實(shí)驗(yàn)室研制、中試研制取得成功的基礎(chǔ)上，向農(nóng)業(yè)部申報(bào)新獸藥證書和生產(chǎn)批準(zhǔn)文號(hào)，本項(xiàng)目成功研制并獲得2個(gè)新獸藥證書和5個(gè)生產(chǎn)批文：H5+H9(N28+SS)、ND+IB+H9（La Sota+M41+SS/94)、H5N1（Re-1)、 H5N1（Re-5)、 H5N1（Re-5+ Re-4)、H9（SS),中試生產(chǎn)及臨床應(yīng)用,申報(bào)新獸藥證書和生產(chǎn)批文,在實(shí)驗(yàn)室試制取得成功的基礎(chǔ)上，在生產(chǎn)車間按照制定的制造及檢驗(yàn)試行規(guī)程連續(xù)生產(chǎn)不少于3批，經(jīng)檢驗(yàn)合格后，申報(bào)獲得臨床批文，對(duì)不同品種普通雞免疫，免疫數(shù)量不少于20000只，通過觀察免疫后的臨床癥狀和檢測(cè)抗體水平，確定試制產(chǎn)品安全有效，同時(shí)最終確定免疫劑量、保存條件和保存期，建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。,4、研制禽流感系列疫苗,三 主要技術(shù)內(nèi)容（6）,5、研究新工藝、新標(biāo)準(zhǔn),（1）采用多級(jí)篩選、保證抗原質(zhì)量： 胚蛋、孵化前期、后期、接種后和收獲前均對(duì)不合格的胚蛋進(jìn)行挑除； （2）篩選優(yōu)化疫苗配方，解決了免疫后出現(xiàn)疫苗殘留、腫塊、肌肉變綠等不良反應(yīng)； （3）對(duì)疫苗乳化顆粒大小進(jìn)行了監(jiān)控，疫苗乳化顆粒大小為0.2-3微米；極大地延長了疫苗保存期（2年），遠(yuǎn)高于國家標(biāo)準(zhǔn)（1年）。,提出了原材料的來源和質(zhì)量要求,改進(jìn)生產(chǎn)工藝,（1）經(jīng)過研究最終確定采用SPF或非免胚蛋培養(yǎng)病毒，能極大地提高病毒滴度并降低了外源病毒的污染； （2）研究、篩選國內(nèi)外油佐劑，最終確定采用進(jìn)口佐劑，相對(duì)傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝疫苗免疫后，HI抗體水平提高1-2滴度。,四 主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn),四 主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)（1）,1、在國內(nèi)首次研究哺乳動(dòng)物禽流感免疫機(jī)理，率先建立禽流感感染模型及模型指標(biāo)。,項(xiàng)目查新結(jié)論,除本項(xiàng)目的相關(guān)研究人員發(fā)表的論文外，未見到國內(nèi)和國外有與本委托項(xiàng)目“禽流感H5N1病毒初次和再次感染中免疫機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究”中較早且系統(tǒng)測(cè)定禽流感H5Nl病毒的哺乳動(dòng)物BABL/C小鼠模型的CD3+T、CD4+T、CD8+T細(xì)胞免疫和IL-2、IL-4、IL-10、 IL-18、TNF-與IFN-細(xì)胞因子變化的創(chuàng)新點(diǎn)相同的文獻(xiàn)報(bào)道，創(chuàng)新點(diǎn)相同的文獻(xiàn)、專利和成果報(bào)道。,四 主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)（2）,2、發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物及單抗物質(zhì)有效防治禽流感。,項(xiàng)目查新結(jié)論,除本項(xiàng)目的相關(guān)研究人員發(fā)表的論文外，未見到國內(nèi)有與本委托項(xiàng)目中直接利用鵝源禽流感H5N1病毒感染哺乳動(dòng)物、在未經(jīng)預(yù)先適應(yīng)的情況下通過鼻腔接種ICR小鼠和BALB/c小鼠或通過“環(huán)甲膜穿刺術(shù)”經(jīng)氣管注射感染恒河猴的造模方法、小鼠模型及恒河猴模型、模型指標(biāo)等創(chuàng)新點(diǎn)相同的文獻(xiàn)、專利和成果報(bào)道。,植物黃酮類化合物的用途,表沒食子兒茶素沒食子酸酯微囊顆粒及其制備工藝,四 主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)（3）,3、研制了防控禽流感的系列疫苗,禽流感（H5+H9）二價(jià)滅活疫苗（N28+SS株）,雞新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感（H9亞型）三聯(lián)活疫苗（La Sota株+M41株+SS/94株）,四 主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)（4）,4、研究新工藝，制定新標(biāo)準(zhǔn)，改善行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。,五 主要技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo)與推廣效益（1）,主要技術(shù)指標(biāo),小鼠和恒河猴模型感染禽流感病毒后，其病理癥狀應(yīng)符合人類感染禽流感疾病的基本特征，成功建立了禽流感的動(dòng)物模型。 建立了抗原濃縮技術(shù)、填補(bǔ)了動(dòng)物疫苗細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)技術(shù)、突破了乳劑疫苗的顆粒度，解決了乳劑疫苗的不穩(wěn)定性和分層，疫苗保護(hù)期延長至2年，完善了疫苗生產(chǎn)新標(biāo)準(zhǔn)。,附：疫苗質(zhì)量新標(biāo)準(zhǔn),主要經(jīng)濟(jì)指標(biāo),2008-2010年項(xiàng)目經(jīng)濟(jì)效益,（單位：萬元/萬美元）,五 主要技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo)與推廣效益（2）,2003-2010年共銷售禽流感疫苗156.24億羽份，年均增長率34%；實(shí)現(xiàn)銷售收入11.44億元，年均增長28%。,五 主要技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo)與推廣效益（3）,主要經(jīng)濟(jì)指標(biāo),2003-2010年禽流感疫苗銷售量（億羽份）,2003-2010年禽流感疫苗銷售收入（萬元）,08-10年H5亞型禽流感疫苗推廣應(yīng)用情況（萬羽份）,五 主要技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo)與推廣效益（4）,越南注冊(cè)證,埃及注冊(cè)證,08-10年禽流感疫苗出口產(chǎn)品情況（萬羽份）,五 主要技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo)與推廣效益（5）,禽流感疫苗是防控疫情的關(guān)鍵，為養(yǎng)禽業(yè)的生產(chǎn)安全保駕護(hù)航?？刂埔咔榘l(fā)生，降低動(dòng)物對(duì)人感染的風(fēng)險(xiǎn)。 近3年銷售禽流感疫苗47.33億毫升，減少禽類捕殺損失1154億元，節(jié)省治療費(fèi)用5億元 H5：69.95億羽份3斤/只5.5元/斤=1154.18億元 H9：24.7億羽份（0.3-0.07）元/只=5.68億元 保證養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展，增加農(nóng)民收入，推進(jìn)“三農(nóng)”工作實(shí)施。,社會(huì)效益,五 主要技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo)與推廣效益（6）,六 相關(guān)知識(shí)產(chǎn)權(quán)與獲獎(jiǎng)勵(lì)情況（1）,獲得發(fā)明專利2個(gè)：-植物黃酮類化合物的用途（授權(quán)號(hào)：ZL 200410074592.8）； -表沒食子兒茶素沒食子酸酯微囊顆粒及其制備工藝（授權(quán)號(hào)： ZL 200710165270.8） 獲得新藥證書2個(gè)：-禽流感(H5+H9)二價(jià)滅活疫苗 證號(hào)： （2006）新獸藥證字33號(hào)； -雞新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感（H9亞型）三聯(lián)滅活疫苗（La Sota株+M41株+SS/94株） 證書號(hào)： （2011）新獸藥證字15號(hào) 獲得生產(chǎn)批文5個(gè)：-禽流感滅活疫苗（H9亞型，SS株） 證號(hào):獸藥生字（2011）190032080； -雞新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感（H9亞型）三聯(lián)滅活疫苗（La Sota株+M41株+SS/94株） 證號(hào):獸藥生字（2011）190032168 -重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型，Re-1株) 證號(hào):獸藥生字（2011）190022098 -重組禽流感病毒H5亞型二價(jià)滅活疫苗（H5N1，Re-5株+Re-4株） 證號(hào):農(nóng)醫(yī)藥便函200927號(hào) -禽流感油乳劑滅活疫苗（H5亞型，N28株) 證號(hào):獸藥生字（2006）190022077,共發(fā)表論文共計(jì)33篇，其中S