《基因工程制藥》PPT課件.ppt

基因工程制藥,基因工程藥物: 利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)人體健康所需的、難以用傳統(tǒng)方法制取的蛋白質(zhì)、多肽和基因等藥物。 基因工程藥物包括: 基因工程治療藥物，基因工程抗體和疫苗，基因治療藥物，基因工程診斷試劑等。,基因工程藥物生產(chǎn)的基本過程,獲得目的基因目的基因克隆構(gòu)建重組表達(dá)載體構(gòu)建、篩選基因工程細(xì)胞工程細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)產(chǎn)物的分離、純化除菌過濾半成品檢定成品檢定包裝。,目的基因的獲得,從基因組中獲得 從基因組文庫中獲得 從cDNA文庫中獲得 PCR擴(kuò)增法 從化學(xué)合成方法中獲得,免疫法分離目的基因,mRNA,選擇宿主細(xì)胞的原則,安全性高、便于導(dǎo)入重組DNA、便于篩選克隆子、重組子能在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定維持、不影響外源基因高效表達(dá)、具有較好的翻譯后加工系統(tǒng)、遺傳密碼無特別的偏倚性、遺傳性穩(wěn)定，易于擴(kuò)大培養(yǎng)、有較高的應(yīng)用價(jià)值。,外源基因表達(dá)常用的宿主細(xì)胞,大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng) 優(yōu)點(diǎn)：遺傳背景、代謝途徑和表達(dá)機(jī)制清楚；易于遺傳學(xué)操作；生長迅速；異源蛋白的高效表達(dá);也可以分泌型表達(dá) 缺點(diǎn)：潛在致熱源；蛋白質(zhì)不分泌到培養(yǎng)基中；無翻譯后修飾系統(tǒng)；異源蛋白而易形成包函體,外源基因表達(dá)常用的宿主細(xì)胞,枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng) 優(yōu)點(diǎn)：不產(chǎn)生內(nèi)毒素；良好的分泌型； 天然構(gòu)象的可能性大。 缺點(diǎn)：外源蛋白表達(dá)量較低；細(xì)胞內(nèi)外高水平的蛋白酶。,外源基因表達(dá)常用的宿主細(xì)胞,釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng) 優(yōu)點(diǎn)：簡單的真核生物，不產(chǎn)生病毒，內(nèi)毒素；遺傳背景清楚；有翻譯后修飾；分泌異源蛋白。 缺點(diǎn)：異源蛋白表達(dá)量低；有超糖基化趨勢；異源蛋白有時(shí)分泌不理想，30Kd不分泌，乙醇積累導(dǎo)致異源蛋白合成不足。,外源基因表達(dá)常用的宿主細(xì)胞,動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) CHO、COS、3T3 優(yōu)點(diǎn)：可分泌異源蛋白；正確的糖基化和翻譯后修飾 缺點(diǎn)：異源蛋白表達(dá)量低；難以大規(guī)模生產(chǎn)；培養(yǎng)基昂貴；培養(yǎng)時(shí)間長；培養(yǎng)條件苛刻,重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的途徑,直接轉(zhuǎn)化法、化合物誘導(dǎo)法、接合轉(zhuǎn)化法、噬菌體轉(zhuǎn)染法、電穿孔轉(zhuǎn)化法、基因槍轟擊法、超聲轉(zhuǎn)化法、脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法、磷酸鈣轉(zhuǎn)化法等。,重組子的鑒定,1. 根據(jù)重組子的特征鑒定 DNA分子的大小、酶切圖譜、PCR擴(kuò) 增片斷、DNA雜交法、DNA測序 2. 根據(jù)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物鑒定 Northern、RT-PCR 3. 根據(jù)翻譯產(chǎn)物鑒定 蛋白電泳、ELISA、Westhern、RIA,異源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)形式 包涵體型表達(dá),包涵體形成的機(jī)理： 外原基因的表達(dá)產(chǎn)率過高。 無真核細(xì)胞的亞細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定因子 宿主細(xì)胞的異源蛋白。 所處的環(huán)境不利于折疊。 高濃度異原蛋白造成高濃度的微環(huán)境。,異源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)形式 包涵體型表達(dá),包涵體-生物大分子致密地聚集在細(xì)胞內(nèi)，形成的高密度、不溶性的無膜的顆粒結(jié)構(gòu)。 包涵體的性質(zhì)-主要是表達(dá)的外原蛋白，其高級(jí)結(jié)構(gòu)往往是錯(cuò)誤的。只有在變性劑中才能溶解。要獲得具有生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)必須將包涵體溶解，釋放出其中的錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)，將各個(gè)次級(jí)鍵打開，在體外進(jìn)行蛋白質(zhì)的重折疊。,異源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)形式 包涵體型表達(dá)的優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)： 外原基因的表達(dá)量極高，對(duì)宿主細(xì)胞的生長和代謝影響小 抗宿主細(xì)胞內(nèi)蛋白酶降解的能力強(qiáng) 目標(biāo)蛋白的純度高，易于分離和純化 缺點(diǎn)： 必須復(fù)性,異源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)形式 分泌型表達(dá),分泌型表達(dá)的特點(diǎn)： 在N端加上能夠跨膜的信號(hào)肽序列。這對(duì)重組蛋白的折疊可能有一定好處；由于跨膜是逐個(gè)進(jìn)行的，蛋白間的交聯(lián)機(jī)會(huì)較少；周質(zhì)中的蛋白酶活性比胞質(zhì)低；周質(zhì)蛋白僅占菌體總蛋白的4%，使之易于純化。但分泌到周質(zhì)中的重組蛋白其構(gòu)象不一定是天然構(gòu)象，在周質(zhì)中的重組蛋白也可能形成包涵體。,異源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)形式 分泌型表達(dá),分泌型表達(dá)的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)-1 可溶性表達(dá) 2 可能接近天然構(gòu)象 3 Met可被切除 缺點(diǎn)-1 表達(dá)量低 2 純化較困難 3 面臨復(fù)性問題,異源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)形式 融合型表達(dá),融合型表達(dá)的特點(diǎn)： 將高量表達(dá)的宿主蛋白基因與外源基因拼接在一起，大量表達(dá)內(nèi)、外原雜合蛋白。在融合蛋白中，外源表達(dá)產(chǎn)物能在菌體蛋白的引導(dǎo)下形成較好的雜合折疊構(gòu)象，封閉了部分重組蛋白上的酶切敏感位點(diǎn)，增加了抗酶解能力。,異源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)形式 融合型表達(dá),融合型表達(dá)的優(yōu)缺點(diǎn)： 優(yōu)點(diǎn)- 1穩(wěn)定性強(qiáng) 2比單純分泌表達(dá)產(chǎn)量高 缺點(diǎn)-1需將融合蛋白兩者分開，對(duì)酶切試劑和工藝的要求高 2可能面臨體外復(fù)性問題,異源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)形式 融合型表達(dá),融合型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建原則： 選擇能夠高效表達(dá)的宿主結(jié)構(gòu)基因， 盡量避免融合蛋白中兩者的理化性質(zhì)過于接近，以利于異原蛋白的分離。 兩種蛋白之間留有特定的分割位點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確分離。,切割融合型蛋白的條件,蛋白內(nèi)切酶的純度一定要高 選用斷裂位點(diǎn)專一性最強(qiáng)的酶 目的蛋白內(nèi)部不存在同樣的切割位點(diǎn) 嚴(yán)格按照相應(yīng)酶切的最佳條件進(jìn)行,幾種常用的融合蛋白表達(dá)載體,Protein A (葡萄球菌A蛋白) GST（谷光甘肽S-轉(zhuǎn)移酶） CBD (幾丁質(zhì)結(jié)合功能區(qū)) (纖維素結(jié)合功能區(qū)) MBP (麥芽糖結(jié)合蛋白) 硫氧還原蛋白 周質(zhì)酶片斷,異源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)形式 寡聚型表達(dá),寡聚型表達(dá)的特點(diǎn)： 單純增加載體數(shù)量，在一定程度上可提高表達(dá)量。然而受體細(xì)胞的大部分能源除了表達(dá)目的基因外，還要表達(dá)載體上更多的，有些是已無關(guān)緊要的產(chǎn)物。因此單純增加質(zhì)粒拷貝數(shù)有時(shí)表達(dá)量也上不去。這時(shí)可考慮采用將一連串外源基因克隆在相對(duì)低拷貝的質(zhì)粒上形成寡聚型表達(dá)，雖拷貝數(shù)少但轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物并不少，在一定程度上節(jié)省了資源。,多表達(dá)單元重組,目的基因,轉(zhuǎn)錄,翻譯,多順反子重組,轉(zhuǎn)錄,翻譯,SD,SD,SD,外源基因,多編碼序列從組,轉(zhuǎn)錄,翻譯,體外切割,外源基因,異源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)形式 整合型表達(dá),整合型表達(dá)的特點(diǎn)： 將外源基因直接整合在宿主細(xì)胞的染色體上，大大增加了外源基因的穩(wěn)定性，并免去了對(duì)宿主細(xì)胞的抗性選擇。最好整合到不干擾宿主細(xì)胞正常生理代謝的非編碼區(qū)中的特定位置。,外源基因染色體定位整合原理,根據(jù)DNA同源交換原理，在外源基因兩側(cè)各組合一段與染色體特定部位完全相同的同源序列。外源基因越長同源序列也需越長。,外源基因在大腸桿菌 中的高效表達(dá)的方法,強(qiáng)化異源蛋白質(zhì)的生物合成 抑制異源蛋白質(zhì)的降解 優(yōu)化菌體培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)的條件,強(qiáng)化異源蛋白質(zhì)的生物合成,提高外源基因的劑量 優(yōu)化轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件 優(yōu)化翻譯元件,提高外源基因的劑量,1. 合理采用高拷貝質(zhì)粒 質(zhì)粒擴(kuò)增多發(fā)生在宿主細(xì)胞生理代謝最旺盛的對(duì)數(shù)生長期內(nèi)，過早的質(zhì)?？焖贁U(kuò)增會(huì)影響宿主的生長與代謝，進(jìn)而導(dǎo)致質(zhì)粒的不穩(wěn)定性。如pCP3表達(dá)質(zhì)粒，大腸桿菌在28度生長時(shí)，盡管到達(dá)對(duì)數(shù)期，但細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒數(shù)也不多，不影響菌體生長。當(dāng)溫度提高至42度時(shí)，質(zhì)?？截悢?shù)可迅速提高10倍。此時(shí)同時(shí)開啟啟動(dòng)子，可大大提高外源基因表達(dá)量。,優(yōu)化轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件 常用的的啟動(dòng)子,最常用大腸桿菌天然啟動(dòng)子有Plac、Ptrp、Pl、PrecA、T7。分別來自乳糖操縱子，色氨酸操縱子，其余來自-噬菌體。T7啟動(dòng)子最常用，它位于pET-3a表達(dá)載體上，宿主菌是BL21（DE3）株，編碼T7-RNA聚合酶。雜合啟動(dòng)子作用更強(qiáng)，如Ptrp和Plac雜合成的Ptac，啟動(dòng)強(qiáng)度分別是Ptrp的3倍和Plac的11倍。啟動(dòng)子的強(qiáng)弱程度還與所控外源基因的性質(zhì)密切相關(guān)。,優(yōu)化轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件 雙啟動(dòng)子表達(dá)載體,為提高轉(zhuǎn)錄活性，增加外源基因的表達(dá)量有時(shí)將兩個(gè)啟動(dòng)子串聯(lián)到一起。 兩個(gè)不同的啟動(dòng)子串聯(lián)， 如 PR+T7 兩個(gè)相同的啟動(dòng)子串聯(lián), 如 T7+T7,在目的基因與一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子重組后，如檢測不到相應(yīng)的mRNA，排除其它因素后，可考慮調(diào)整啟動(dòng)子與目的基因間的距離?？捎煤怂嵬馇忻笇⒛康幕虻纳嫌吻谐刹煌拈L度，在將啟動(dòng)子與目的基因連接和克隆，最后檢測表達(dá)量。,優(yōu)化轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件 啟動(dòng)子的位置,優(yōu)化轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件 操縱子的選擇,使用操縱子的原因 象質(zhì)粒擴(kuò)增對(duì)宿主細(xì)胞的影響一樣。高水平的全程表達(dá)，對(duì)宿主菌生長極為不利。會(huì)導(dǎo)致宿主菌能量耗盡，代謝終止而死亡。受到高負(fù)荷的宿主菌在傳代過程中會(huì)將重組質(zhì)粒部分或全部丟失。最終篩選出低效表達(dá)或不表達(dá)外源基因的宿主細(xì)胞群體。,乳糖操縱子結(jié)構(gòu),調(diào)節(jié),操縱,啟動(dòng),CRP,乳糖分解和利用的酶,乳糖,阻遏蛋白,結(jié)構(gòu)基因,優(yōu)化轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件 常用的操縱子及誘導(dǎo)條件,-噬菌體啟動(dòng)子-去阻遏途徑復(fù)雜，難以化學(xué)誘導(dǎo)。一般采用其阻遏基因溫度敏感型突變體的操縱子。采用變溫誘導(dǎo)，宿主菌擴(kuò)增溫度為28-30度，需要時(shí)變溫至42度，使阻遏蛋白失活，從操縱子上脫落，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。,優(yōu)化轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件 阻遏蛋白量對(duì)操縱子的影響,操縱子抑制作用的強(qiáng)弱很大程度上取決于阻遏蛋白的數(shù)量，數(shù)量過低抑制效果不佳。可把阻遏蛋白基因克隆到另一個(gè)低拷貝質(zhì)粒上，確保阻遏蛋白分子數(shù)和啟動(dòng)子拷貝數(shù)維持在一個(gè)合適的比例上，強(qiáng)化阻遏作用。,優(yōu)化轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件 終止子,強(qiáng)啟動(dòng)子控制易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過頭的現(xiàn)象，形成長短不一的mRNA混合物。嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)錄和翻譯效率。外源基因下游如有載體質(zhì)粒的重要基因功能區(qū)，這種干擾可能是致命的。至少也會(huì)由于生成大量廢物蛋白而耗費(fèi)能量。必須選擇強(qiáng)的終止子，必要時(shí)采用雙終止子結(jié)構(gòu)。,優(yōu)化轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件 終止子,強(qiáng)啟動(dòng)子有時(shí)除發(fā)生轉(zhuǎn)錄過頭現(xiàn)象外，有時(shí)甚至可以發(fā)生反向轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄出與mRNA互補(bǔ)的反義序列，造成模板封閉。 終止子附近有豐富的GC反向互補(bǔ)序列，配對(duì)折疊成終止發(fā)夾結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可使RNA聚合酶移動(dòng)緩慢或暫時(shí)停止，下游寡聚U結(jié)構(gòu)是獨(dú)立型終止子的終止信號(hào)。 轉(zhuǎn)錄完成的重要標(biāo)志是有poly A的摻入。,優(yōu)化翻譯元件 SD序列與起始密碼子區(qū)間的優(yōu)化,SD序列與起始密碼子間精確距離保正了核糖體定位，翻譯起始密碼子AUG正好處在核糖體上的給位（P）。在大多情況下SD序列位于AUG前大約7個(gè)堿基處。如有必要可對(duì)這距離進(jìn)行優(yōu)化。 SD序列與起始密碼子間的堿基組成對(duì)不同的外源基因表達(dá)也有影響，特別是AUG前3個(gè)堿基的組成對(duì)翻譯起始影響更大。,優(yōu)化翻譯元件,a,AUG,5,3,SD序列 結(jié)合核糖體 優(yōu)化與核糖體的結(jié)合強(qiáng)度以 提高翻譯效率,3-10bp,SD與AUG的間距 優(yōu)化距離使AUG 處于核糖體給位 優(yōu)化堿基組成以 求翻譯最佳效率,此區(qū)不可 與前面有 互補(bǔ)序列 以免形成 莖環(huán)等明 顯二級(jí)結(jié)構(gòu),UAAGGAGG,優(yōu)化翻譯元件（4） 簡并密碼子,人的61個(gè)編碼密碼子中只有14個(gè)使用頻率超過1.0%，其中最大只有 2.18%（平均1.50%）。 大腸桿菌61個(gè)編碼密碼子中卻有29個(gè)使用頻率超過1.0%，其中最大達(dá)到7.69%（平均2.88%)。另有9個(gè)編碼密碼子使用頻率為零。 以下為9個(gè)大腸桿菌根本不用的密碼子(括號(hào)中為人該密碼子的使用頻率%）。 CUA(0.31)，AUA(0.18)，CCC(0.76)，ACG(0.27)，CGA(0.18)，CGG(0.22)，AGG(0.45)，GGA(0.71)，GGG(0.49)。,密碼子偏愛性的特點(diǎn),密碼子與反密碼子的結(jié)合強(qiáng)度差異： 結(jié)合強(qiáng)度大，tRNA離開核糖體給位的時(shí)間長，結(jié)合強(qiáng)度弱 ，tRNA進(jìn)入核糖體受位的時(shí)間長?？赡苁瞧珢墼虻乃?。 不同細(xì)胞內(nèi)tRNA含量的差異： 表達(dá)量高-密碼子種類少-相應(yīng)的tRNA多 表達(dá)量少-密碼子多-相應(yīng)的tRNA少,優(yōu)化翻譯元件（6） 簡并密碼子使用的優(yōu)化,按照宿主的偏愛性來選擇它們偏愛的密碼子。替換密碼子堿基可參照宿主細(xì)胞的密碼子使用頻率表。如 CCC為0，而改為CCG為2.98 外源基因的全程替換，做起來比較困難，可能也沒有必要。 從外源基因密碼子中選出幾個(gè)宿主細(xì)胞最不喜歡選用的主密碼子，加以替換，測定表達(dá)結(jié)果。,優(yōu)化翻譯元件（7） 簡并密碼子使用的優(yōu)化,對(duì)于那些富含宿主細(xì)胞討厭密碼子的大分子外源基因，可選擇： 同步克隆表達(dá)法：將一些在宿主細(xì)胞中含量低的tRNA編碼基因，克隆在另一個(gè)高表達(dá)質(zhì)粒上，以彌補(bǔ)由于宿主細(xì)胞幾種tRNA分子匱乏造成的，對(duì)外源基因翻譯的限制作用。,終止密碼子,在終止密碼子處新生肽與mRNA分離，新生多肽釋放因子RF1 識(shí)別 UAA 和 UAG，RF2 識(shí)別 UAA 和 UGA。由于兩個(gè)釋放因子都能識(shí)別UAA，故UAA的終止效果最好。為保證翻譯的有效終止，可將幾個(gè)終止密碼子串聯(lián)在一起。有報(bào)道說 UAAU的翻譯終止效果甚佳。,蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng),原核生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶解系統(tǒng)較為發(fā)達(dá)，特別針對(duì)異源蛋白，尤其是在異源蛋白折疊不佳的情況下，更易受到宿主細(xì)胞蛋白酶的降解。改進(jìn)方法有： 選用蛋白酶缺陷型受體細(xì)胞 外源基因產(chǎn)物序列的改造,蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng) 抗蛋白酶重組異源蛋白序列改造,有些氨基酸序列能夠抗大腸桿菌蛋白酶的降解。如C端存在極性氨基酸時(shí)會(huì)提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，如在C端引入天門冬氨酸能顯著延長蛋白質(zhì)的半衰期。在N端連上連接上某個(gè)氨基酸會(huì)使穩(wěn)定性大為增強(qiáng)，應(yīng)避免蛋白酶易感序列，如N端的PEST序列。,基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn),結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性：重組載體分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排或修飾等改變導(dǎo)致重組體的功能部分或全部喪失。 分裂不穩(wěn)定性：重組體從宿主細(xì)胞中逃逸(curing)，導(dǎo)致重組體的功能全部喪失。,工程菌遺傳不穩(wěn)定性的產(chǎn)生原因,外源基因的高效表達(dá)嚴(yán)重地干擾了宿主細(xì)胞的生長代謝過程。這些干擾可誘導(dǎo)菌體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，包括關(guān)閉自身的生物合成，啟動(dòng)核酸酶和蛋白酶基因的表達(dá)，將外原基因或表達(dá)產(chǎn)物降解。 外原基因大量表達(dá)，使不含或少含重組質(zhì)粒細(xì)胞在繁殖上逐漸占優(yōu)勢。導(dǎo)致胞分裂時(shí)質(zhì)粒的分配不均。 應(yīng)激反應(yīng)激活宿主細(xì)胞內(nèi)源性轉(zhuǎn)位因子，促進(jìn)重組載體片斷的缺失和重排。,重組質(zhì)粒的宏觀逃逸率,重組質(zhì)粒的宏觀逃逸率 = 不攜帶重組質(zhì)粒的細(xì)胞數(shù) / 總細(xì)胞數(shù) 100 % 例：每代基因工程菌的宏觀逃逸率為0.1%，不含重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞其比生長速率是含重組質(zhì)粒細(xì)胞的1.5倍，在分裂第25代時(shí)的宏觀逃逸率為99.9%！ 大規(guī)模發(fā)酵已逐漸不允許使用抗生素進(jìn)行壓力選擇。加重了問題的嚴(yán)重性。,改進(jìn)載體宿主系統(tǒng),增加質(zhì)?？截惥夥峙洌≒ar）基因。 正確設(shè)置載體上的多克隆位點(diǎn)，防止外源基因插入質(zhì)粒上的穩(wěn)定區(qū)。 選擇對(duì)重組質(zhì)粒耐受性好的宿主菌。 除去宿主菌染色體DNA上的轉(zhuǎn)座元件。,施加選擇壓力,抗生素添加法-利用抗性基因，將抗生素加入到培養(yǎng)體系中。 抗生素依賴法-將宿主菌誘變成抗生素依賴突變株，在質(zhì)粒上引入該抗生素的非依賴性基因。 營養(yǎng)缺陷法-滅活某種細(xì)胞生長必須的基因，獲得營養(yǎng)缺陷型突變株。將滅活的基因克隆到質(zhì)粒上，建立互補(bǔ)關(guān)系。,基因工程菌的大規(guī)模培養(yǎng),基因工程下游技術(shù)的開始,原始種子庫和生產(chǎn)種子庫,生物制品生產(chǎn)采用種子批系統(tǒng)。原始種子庫應(yīng)驗(yàn)明其紀(jì)錄、歷史、來源和生物學(xué)特性。從原始種子庫傳出、擴(kuò)增后動(dòng)干保存的為生產(chǎn)用種子庫。生產(chǎn)用種子批的生物學(xué)特征應(yīng)與原始種子批一致。每批生產(chǎn)用種子批均應(yīng)按規(guī)程要求保管、鑒定和使用。,制造菌種庫的建立,從原始菌種庫傳出，經(jīng)擴(kuò)大后凍干保存，或由上一代制造菌種庫傳出，擴(kuò)大后凍干保存，作為制造菌種庫，但每次只限傳三代。每批制造菌種庫應(yīng)進(jìn)行下列鑒定，合格后方可投入生產(chǎn)。,生產(chǎn)用菌種庫的鑒定,形態(tài)學(xué)鑒定、革蘭氏染色、生化反應(yīng)鑒定、抗生素抗性鑒定、重組質(zhì)粒穩(wěn)定性的測定、表達(dá)穩(wěn)定性鑒定、表達(dá)產(chǎn)物抗原抗體反應(yīng)鑒定、重組質(zhì)粒酶切圖譜鑒定、菌落原位雜交及污染檢測鑒定等。,分批式發(fā)酵的特點(diǎn),分批發(fā)酵可以看成一個(gè)封閉的系統(tǒng)，所有的培養(yǎng)成分一次性投入發(fā)酵罐中，滅菌后直接接種開始發(fā)酵。在整個(gè)發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基的組成、菌體濃度、細(xì)胞內(nèi)代謝物質(zhì)成分以及外源基因產(chǎn)物均隨著細(xì)菌的生長狀態(tài)、細(xì)胞代謝途徑和營養(yǎng)成分利用率的變化而變化。,分批式發(fā)酵的四個(gè)時(shí)相,潛伏期,對(duì)數(shù)期,穩(wěn)定期,衰亡期,LogN,T,補(bǔ)料式發(fā)酵,一種或多種營養(yǎng)成分定時(shí)加入培養(yǎng)系統(tǒng)中，可防止某些限制性營養(yǎng)成分在培養(yǎng)過程中被耗盡而影響細(xì)胞的生長和產(chǎn)物形成?？梢栽谝欢ǔ潭妊泳弻?duì)數(shù)期和穩(wěn)定期，提高菌體密度和表達(dá)量。通常用一些發(fā)酵參數(shù)的變化來間接估算補(bǔ)料時(shí)間和規(guī)模。流加發(fā)酵比較適于基因工程菌的培養(yǎng)，但工藝控制較為嚴(yán)格。,連續(xù)式發(fā)酵,為一個(gè)開放的發(fā)酵系統(tǒng)，培養(yǎng)基不斷進(jìn)出，細(xì)胞的總數(shù)和培養(yǎng)液的總體積維持恒定，形成穩(wěn)態(tài)。連續(xù)發(fā)酵中細(xì)胞的生理狀態(tài)相當(dāng)穩(wěn)定，產(chǎn)量與質(zhì)量也較為恒定。生產(chǎn)相同量的產(chǎn)品所用的設(shè)備??；對(duì)處理量要求較低；有效縮短發(fā)酵設(shè)備的停工期；生物產(chǎn)品的成本遠(yuǎn)低于其他的發(fā)酵方法。,發(fā)酵過程的優(yōu)化控制,基因工程菌的大規(guī)模發(fā)酵與普通發(fā)酵相比，其顯著特征是在細(xì)胞內(nèi)增加了一條相對(duì)獨(dú)立的代謝途徑，菌體的其它代謝途徑都要受到重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)和重組蛋白的表達(dá)量的影響?；蚬こ叹l(fā)酵過程的優(yōu)化可以圍繞以下三個(gè)層次進(jìn)行。即工程水平、分子水平和細(xì)胞水平的優(yōu)化控制。,工程水平的優(yōu)化控制,要能補(bǔ)足大量的空氣，必要時(shí)補(bǔ)充純氧。要有除泡沫措施，要能將氣體懸浮及氣泡的破碎，要有調(diào)節(jié)培養(yǎng)液酸堿度的措施。 能夠恒溫和迅速變溫，找到表達(dá)最佳狀態(tài)。 能夠均勻適度的混合。有利于加快營養(yǎng)成分和溶氧的傳遞，促進(jìn)熱量的散發(fā)以及降低細(xì)胞有毒代謝產(chǎn)物的局部濃度等。,細(xì)胞水平的優(yōu)化控制,優(yōu)化發(fā)酵過程中的細(xì)胞密度、調(diào)整代謝途徑及產(chǎn)物比生長產(chǎn)率等。實(shí)驗(yàn)證明，重組蛋白的最大合成量和受體菌代謝活力的維持，往往與細(xì)菌較低的生長速率相伴。但降低生長速率必須在擁有一定的細(xì)胞密度的基礎(chǔ)上才能有助于提高重組蛋白的宏觀表達(dá)量。,分子水平的優(yōu)化控制,外源基因的表達(dá)控制。工程菌構(gòu)建只是為表達(dá)調(diào)控提供了可能性，必須通過各種手段在菌體生長過程中得以實(shí)現(xiàn)。具體方法見載體構(gòu)建。 細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)生物合成系統(tǒng)的均衡。合理控制細(xì)菌基因表達(dá)的時(shí)間與強(qiáng)度，有利于細(xì)胞內(nèi)幾種代謝途徑的和諧與穩(wěn)定。 重組質(zhì)?？截悢?shù)的維持。質(zhì)粒的過高拷貝會(huì)耗費(fèi)大量能量，表達(dá)更多的無效產(chǎn)品，不僅影響菌體的生長代謝，且不利與其穩(wěn)定性。,動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng),優(yōu)點(diǎn)：可分泌異源蛋白；正確的糖基化和翻譯后修飾；正確的蛋白分子構(gòu)象。 缺點(diǎn)：異源蛋白表達(dá)量低；難以大規(guī)模生產(chǎn)；培養(yǎng)基昂貴；培養(yǎng)時(shí)間長；易于污染；培養(yǎng)條件苛刻。,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中血清的使用,血清對(duì)動(dòng)物細(xì)胞的生長有很大作用，但其確切作用還未充分確定 血清的存在是產(chǎn)物純化的主要障礙。 常受病毒、支源體等微生物的污染。 血清不僅有生長促進(jìn)活力，而且有生長抑制活力。 是細(xì)胞培養(yǎng)基高成本的主要因素。 生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化難以實(shí)現(xiàn)。,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式,分批式：適用于表達(dá)產(chǎn)物僅在某一時(shí)相有最高的表達(dá)量。 流加式與連續(xù)操作式特點(diǎn)基本同發(fā)酵。 換液培養(yǎng)：不斷置換一部分培養(yǎng)液，可以反復(fù)收獲產(chǎn)物，對(duì)分泌性比表達(dá)特別適用，尤其對(duì)微載體培養(yǎng)。,動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng),將細(xì)胞接種在柱型瓶的瓶壁，培養(yǎng)過程中轉(zhuǎn)瓶不斷轉(zhuǎn)動(dòng)。 優(yōu)點(diǎn)：投資少，技術(shù)成熟，重現(xiàn)性好，溶氧和pH不需調(diào)節(jié)，放大只是簡單地增加轉(zhuǎn)瓶的數(shù)量。 缺點(diǎn)：勞動(dòng)強(qiáng)度大，單位體積提供細(xì)胞的表面極小，占用空間大，按體積計(jì)算細(xì)胞產(chǎn)率低。,動(dòng)物細(xì)胞的微載體培養(yǎng), 細(xì)胞貼附在微載體顆粒上，經(jīng)攪拌懸浮培養(yǎng)，是單層培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的結(jié)合。 優(yōu)點(diǎn)：具有兩種培養(yǎng)方法的優(yōu)點(diǎn)；表面積/體積比極大；細(xì)胞生長環(huán)境均一；培養(yǎng)基利用效率高；重現(xiàn)性好；收獲過程不復(fù)雜；勞動(dòng)強(qiáng)度小；占用空間小，非常適用于大規(guī)模培養(yǎng)。 缺點(diǎn)：微載體培養(yǎng)時(shí)表達(dá)載體容易丟失，質(zhì)粒穩(wěn)定不好一般不能使用這種方法。,微載體必備的條件,對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞無毒 與細(xì)胞有良好的相容性 密度要稍大于培養(yǎng)基 顆粒度均勻，表面平滑，柔性材料， 具有良好的透明性， 耐高溫、高壓，可滅菌 收獲細(xì)胞或細(xì)胞制品容易。,微載體的幾種形式,毛玻璃珠微載體：效果較好，可包被粘性物質(zhì)，穩(wěn)定性好，可重復(fù)利用。 液膜微載體：一種有機(jī)相在液相中形成的液珠。與細(xì)胞的培養(yǎng)基攪拌混合后，該化合物隨即分散成微珠，細(xì)胞貼附于上并擴(kuò)增，停機(jī)后離心，兩相自動(dòng)分開，細(xì)胞自動(dòng)懸浮于兩相之間。 大孔微載體：細(xì)胞可鉆到內(nèi)部，加大了載體表面積，細(xì)胞的抗性增加。,微囊化培養(yǎng)方法,將細(xì)胞包繞在營養(yǎng)物質(zhì)可以自由進(jìn)出的半透膜內(nèi)，細(xì)胞在微囊內(nèi)擴(kuò)增表達(dá)。由于囊膜保護(hù)，使細(xì)胞不易受到機(jī)械損傷。根據(jù)微囊的截留值不同，分泌表達(dá)物質(zhì)可被截留在位囊膜內(nèi)，培養(yǎng)結(jié)束后破囊提取，也可釋放到囊膜外，易于分離。,不同部位表達(dá)效果鑒定,溶菌酶消化后離心取上清 反復(fù)凍融后離心取上清 超聲破碎后離心取沉淀 電泳確定重組蛋白在周質(zhì),細(xì)胞質(zhì)及包涵體中的分布情況。,基因工程菌的裂解方法,高速球磨法：珠子與與細(xì)胞間碰撞剪切 高壓勻漿法：高壓擠壓，高速噴出碰撞 超聲破碎法：高頻震動(dòng)，沖擊波剪切力 酶溶解法：消化細(xì)胞膜與細(xì)胞壁 化學(xué)滲透法：去垢劑、金屬鰲合劑、變性劑、有機(jī)溶劑 凍融破碎法：膜疏水鍵斷裂，冰晶膨脹,包涵體的溶解,在復(fù)性純化前，必須使包涵體充分變性、溶解。 不含二硫鍵多肽的可用8M尿素或6M鹽酸胍等變性劑溶解，有時(shí)也要加還原劑。 含二硫鍵的多肽需添加2-MT或DTT等還原劑，必要時(shí)需排空氣，充氮?dú)?，使二硫鍵充分還原。 加入EDTA或 EGTA，用來抑制金屬離子與還原狀態(tài)的巰基間發(fā)生的氧化反應(yīng)和抑制某些酶。 加入蛋白酶抑制劑等。,變性蛋白的層析純化,凝膠過濾法：在含有變性劑和還原劑的條件下進(jìn)行層析分離，流速要慢。此法可能是大規(guī)模生產(chǎn)中的一個(gè)限速步驟。 離子交換法：變性劑對(duì)離子交換的效果可能有一定影響。由于高濃度鹽酸胍的高離子強(qiáng)度，其變性液中的蛋白質(zhì)不能用于離子交換分離。,重組蛋白的復(fù)性操作,目前重組蛋白已達(dá)數(shù)千多種，其中大腸桿菌表達(dá)占90%以上，絕大多數(shù)以包涵體形式存在，只有復(fù)性才能恢復(fù)其活性。 折疊復(fù)性是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，除對(duì)復(fù)性過程的控制相關(guān)外，還蛋白質(zhì)本質(zhì)有關(guān)，有些蛋白非常容易復(fù)性，有些蛋白體外根本無法復(fù)性。至今也沒找到針對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)體外復(fù)性的通用方法。,體外復(fù)性的影響因素,蛋白質(zhì)在復(fù)性過程中涉及兩種疏水作用，分子內(nèi)的疏水作用，可促進(jìn)蛋白質(zhì)正確折疊；二是分子間的疏水作用，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集。 復(fù)性過程中有三類二硫鍵配合方式，即分子內(nèi)正確、分子內(nèi)錯(cuò)誤及分子間錯(cuò)誤配合方式。 肽鏈折疊還受到周圍環(huán)境的影響，如溫度、pH值、離子強(qiáng)度、復(fù)性時(shí)間等因素的影響。,包涵體蛋白,分子內(nèi)二硫鍵的正確配對(duì),折疊,折疊,聚集,聚集,沉淀,沉淀,還原態(tài),天然態(tài),聚集,聚集,沉淀,沉淀,共價(jià),共價(jià),共價(jià),共價(jià),蛋白折疊過程中的動(dòng)力學(xué)模型,影響復(fù)性效率的因素,