生物技術(shù)制藥總結(jié)1

第一章 緒論一、生物技術(shù)的發(fā)展簡史答：以技術(shù)特征來分可分為：傳統(tǒng)生物技術(shù)，近代生物技術(shù)，現(xiàn)代生物技術(shù)1、傳統(tǒng)生物技術(shù)階段 遠(yuǎn)古人們對微生物的利用，釀造技術(shù) 1680年發(fā)現(xiàn)了微生物、揭示了發(fā)酵現(xiàn)象的奧秘 19世紀(jì)末，20世紀(jì)30年代出現(xiàn)了工業(yè)發(fā)酵、開創(chuàng)了工業(yè)微生物的新時期特點：生產(chǎn)過程簡單、生產(chǎn)設(shè)備要求低、產(chǎn)品多為結(jié)構(gòu)簡單的初級代謝產(chǎn)物2、近代生物技術(shù)階段 1941年，開發(fā)研究青霉素 抗生素工業(yè) 氨基酸發(fā)酵工業(yè) 20世紀(jì)50年代 酶制劑工業(yè) 20世紀(jì)60年代特點 ：產(chǎn)品類型多、生產(chǎn)技術(shù)要求高、生產(chǎn)設(shè)備規(guī)模巨大、技術(shù)發(fā)展速度快。 3、現(xiàn)代生物技術(shù)階段 1953年watson ,crick.提出生命基本物質(zhì)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型 1974年Boyer和Cohen建立了DNA重組技術(shù) 1975年，雜交瘤技術(shù)（抗體工程） 1977年，基因操作手段獲得生長激素抑制因子。胰島素等克隆。 1982年基因工程產(chǎn)品被投放市場。 2001年人類基因組草圖完成特點：（1）基因操作技術(shù)日新月異（2）新技術(shù)新方法迅速應(yīng)用（3）基因工程藥物和疫苗研究開發(fā)快（4）新的生物治療制劑產(chǎn)業(yè)化前景光明（5）轉(zhuǎn)基因動、植物取得重大突破（6）現(xiàn)代生物技術(shù)給農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)帶來飛躍（7）重要基因的結(jié)構(gòu)和功能研究是今后的研究熱點（8）基因治療取得了大的進(jìn)展（9）蛋白質(zhì)工程的發(fā)展（10）生物信息學(xué)的發(fā)展二、生物技術(shù)藥物的分類：（1）應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造的基因重組多肽、蛋白質(zhì)類治療藥物（2）基因藥物（3）動物、植物和微生物的天然藥物（4）合成和部分合成的生物藥物。按功能分類（1）治療藥物（2）預(yù)防藥物（3）診斷藥物。三、生物技術(shù)制藥的特征：高技術(shù)，高投入，長周期，高風(fēng)險，高收益。四、利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的兩個不同途徑：1.用克隆的基因表達(dá)生產(chǎn)有用的肽類和蛋白質(zhì)藥物或疫苗。2.利用基因工程技術(shù)改造傳統(tǒng)的制藥工業(yè)。五、生物技術(shù)所含有的主要技術(shù)范疇：基因工程、細(xì)胞工程、酶工程、發(fā)酵工程及生化工程。基因工程是生物技術(shù)的核心和關(guān)鍵，是主導(dǎo)技術(shù)；細(xì)胞工程是生物技術(shù)的基礎(chǔ)；酶工程是生物技術(shù)的條件；發(fā)酵工程是生物技術(shù)獲得最終產(chǎn)品的手段，四個方面相互聯(lián)系。六、生物技術(shù)概念：以生命科學(xué)為基礎(chǔ)，利用生物體的特性和功能，設(shè)計構(gòu)建具有預(yù)期性狀的新物種或新品系，并與工程相結(jié)合，利用這樣的新物種進(jìn)行加工生產(chǎn)，為社會提供商品和服務(wù)的一個綜合性的技術(shù)體系。第二章 基因工程制藥一、基因工程新藥：免疫性蛋白，細(xì)胞因子，激素，酶類。二、基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥品的優(yōu)點（簡答）：1.利用基因工程技術(shù)可大量生產(chǎn)過去難以獲得的生理活性蛋白和多肽（胰島素，干擾素，細(xì)胞因子等）。2.可以提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)，以便對其生理、生化和機(jī)構(gòu)進(jìn)行深入的研究，從而擴(kuò)大這些物質(zhì)的應(yīng)用范圍。3.利用基因工程可以發(fā)現(xiàn)挖掘更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)。4.可以彌補(bǔ)內(nèi)源生理活性物質(zhì)藥物的不足，并對其進(jìn)行改造。5.利用基因工程技術(shù)可獲得新型化合物，擴(kuò)大藥物篩選來源。三、目的基因的獲得原核細(xì)胞（較易獲得目的基因）基因組較小，可直接分離獲得?；蚪M限制性內(nèi)切酶水解成若干片段探針篩選提純擴(kuò)增真核生物：一個單拷貝基因僅占整個基因組的10 甚至更少，不易獲得。構(gòu)建cDNA文庫構(gòu)建基因文庫人工合成PCR擴(kuò)增四、DNA文庫：通過重組、克隆保存在宿主細(xì)胞中的各種DNA分子的集合體。文庫保存了該種生物的全部遺傳信息，需要時可從中分離獲得。五、cDNA文庫：以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄出的DNA稱cDNA。利用某種生物的總mRNA合成cDNA，再將這些cDNA與載體連接，轉(zhuǎn)入細(xì)菌細(xì)胞中進(jìn)行保存和擴(kuò)增，稱cDNA文庫。特點：（1）不含內(nèi)含子序列。（2）可以在細(xì)菌中直接表達(dá)。（3）包含了所有編碼蛋白質(zhì)的基因。（4）比DNA文庫小的多，容易構(gòu)建。如何構(gòu)建cDNA文庫：cDNA以mRNA為模板經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而成，故須選擇mRNA豐富、較易獲得的、目的基因表達(dá)活躍的組織細(xì)胞為材料。（1）修飾cDNA兩端接頭：人工合成的雙鏈寡核苷酸，二端均為平頭或含酶切位點。銜接頭：一端為平頭，一端為粘末端。（2）cDNA與載體相連各cDNA各自與一個載體在T4連接酶作用下以粘末端互相連接，即為重組DNA 分子。（3）導(dǎo)入宿主細(xì)胞 重組體在一定條件下導(dǎo)入宿主細(xì)胞培養(yǎng)或保存。宿主細(xì)胞必須是來自一個細(xì)胞的克隆體，以保證它們的遺傳性狀相同。六、篩選目的基因 1編碼序列富集法。2島嶼獲救PCR法。3動物雜交法。4功能克隆法。5構(gòu)建cDNA文庫。6差異顯示技術(shù)的應(yīng)用。七、表達(dá)載體具備的條件：1，載體能夠獨立地復(fù)制。2，應(yīng)具有靈活的克隆位點和方便的篩選標(biāo)記。3，應(yīng)具有很強(qiáng)的啟動子。4，應(yīng)具有阻遏子，使啟動子受到控制，只有當(dāng)受到誘導(dǎo)時才能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。5，應(yīng)具有很強(qiáng)的終止子，以便使RNA聚合酶集中力量轉(zhuǎn)錄克隆的外源基因，而不轉(zhuǎn)錄其它無關(guān)的基因，同時很強(qiáng)的終止子所產(chǎn)生的mRNA較為穩(wěn)定。6，所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號。六、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中常用的啟動子：trp啟動子、lac啟動子、tac啟動子、入Pl啟動子。七、大腸桿菌表達(dá)外源蛋白質(zhì)的優(yōu)缺點：細(xì)胞質(zhì)中：優(yōu)點：1，形成包涵體。2，蛋白質(zhì)產(chǎn)量高。3，表達(dá)的鍵簡單。 缺點：1，形成包涵體。2，還原環(huán)境不利于二硫鍵的形成。3，N-末端真實性受影響。4，蛋白質(zhì)酶解。5，種類分離純化復(fù)雜。細(xì)胞周質(zhì)：優(yōu)點：1，由于周質(zhì)蛋白質(zhì)種類少，純化簡單。2，蛋白質(zhì)酶解不甚嚴(yán)重。3，促進(jìn)二硫鍵形成與蛋白質(zhì)折疊作用。4，蛋白質(zhì)N-末端結(jié)構(gòu)真實。 缺點：1，信號肽并非總有助于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運。2，有可能形成包涵體。細(xì)胞外：優(yōu)點：1，酶解作用程度低。2，容易純化。3，促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊作用。4，蛋白質(zhì)N-末端結(jié)構(gòu)真實。 缺點：1，大腸桿菌中表達(dá)真實的外源蛋白質(zhì)不會分泌到細(xì)胞外。2，分泌在細(xì)胞內(nèi)的稀釋，分離純化相當(dāng)復(fù)雜。融合蛋白：真核基因在大腸桿菌中表達(dá)時，產(chǎn)生的一種氨基端是原核序列，羧基端是真核序列，由一條短的原核多肽和真核蛋白結(jié)合在一起的蛋白。九、大腸桿菌表達(dá)中遇到的問題：1，內(nèi)含子 mRNA 酶系 錯誤產(chǎn)物。2，轉(zhuǎn)錄信號不同。3，分子結(jié)構(gòu)。4，真核蛋白質(zhì)分離加工。5，降解。十、基因工程菌遺傳的不穩(wěn)定性的表現(xiàn)：1.結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性：重組DNA分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失,重排,修飾,導(dǎo)致其表觀生物學(xué)功能的喪失。2,分配不穩(wěn)定性：整個重組DNA分子從受體細(xì)胞中逃逸。十一、基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性的產(chǎn)生機(jī)制（導(dǎo)致質(zhì)粒不穩(wěn)定性的原因）：1， 受體細(xì)胞中的限制修飾系統(tǒng)對外源重組DNA分子的降解。2， 外源基因的高效表達(dá)嚴(yán)重干擾受體細(xì)胞正常的生長代謝。3， 重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞分裂時的不均勻分配。4， 受體細(xì)胞中內(nèi)源性的轉(zhuǎn)座元件促進(jìn)重組分子的缺失重排。十二、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法：選擇合適的宿主菌。選擇合適的載體。選擇壓力。分階段控制培養(yǎng)?？刂婆囵B(yǎng)條件。固定化。一些基因重組菌在復(fù)合培養(yǎng)基中顯示較高的質(zhì)粒穩(wěn)定性。十四、培養(yǎng)基常用碳源：葡萄糖，甘油，乳糖，甘露糖，果糖。 氮源：酵母粉，蛋白胨，酪蛋白水解物，玉米漿，氨水，硫酸銨，氯化銨十三、基因工程菌的培養(yǎng)方式：1，分批培養(yǎng)：將種子接入發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過一段時間后，間歇或連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進(jìn)一步生長的培養(yǎng)方法。2，連續(xù)培養(yǎng)：是將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中，攪拌培養(yǎng)至菌體濃度達(dá)一定程度后，開動進(jìn)料和出料蠕動泵，以一定稀釋率進(jìn)行不間斷培養(yǎng)。3，透析培養(yǎng)：是利用膜的半透性原理使培養(yǎng)物和培養(yǎng)基分離，其主要目的是通過去除培養(yǎng)液中的代謝產(chǎn)物來解除其對生產(chǎn)菌的不利影響。4，固定化培養(yǎng)：基因工程菌經(jīng)過固定化后，質(zhì)粒的穩(wěn)定性大大提高，便于進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，對分泌型菌更為有利。不同的碳源對菌體生長和外源基因表達(dá)有較大影響：使用葡萄糖和甘油菌體比生長速率和呼吸強(qiáng)度相差不大。葡萄糖對lac啟動子有抑制作用。用甘露糖做碳源不產(chǎn)生乙酸。乳糖啟動子使用乳糖作碳源較為有利，乳糖同時還起誘導(dǎo)作用。無機(jī)磷的影響：過量的無機(jī)磷會刺激葡萄糖的利用、菌體生長和氧消耗。在低磷濃度下，盡管最大菌體濃度較低，但產(chǎn)物比產(chǎn)率及產(chǎn)物濃度都最高。啟動子只有在低磷酸鹽的情況下才被啟動。溫度的影響：溫度對基因表達(dá)調(diào)控作用可發(fā)生在復(fù)制，轉(zhuǎn)錄，翻譯或小分子調(diào)節(jié)分子合成水平上。大腸桿菌合成青霉素酰化酶不僅受苯乙酸誘導(dǎo)和葡萄糖調(diào)控，而且受溫度調(diào)控。是由于影響了細(xì)胞內(nèi)青霉素?；竚RNA的濃度。十五、如何建立基因工程菌分離工藝一、建立分離純化工藝需了解的各種因素：1，含目的產(chǎn)物的起始物料的特點。1）菌種類型及其代謝特性。2）原材料和培養(yǎng)基的來源及其質(zhì)量。3）生產(chǎn)工藝和條件。4）初始物料的物理化學(xué)和生物學(xué)特性。2，物料中雜質(zhì)的種類和性質(zhì)。3，目的產(chǎn)物特性4，產(chǎn)品質(zhì)量的要求。二、分離純化的基本過程：細(xì)胞破碎，固液分離，濃縮與初步純化，高度純化直至得到成品，成品加工。細(xì)胞破碎的方法：機(jī)械法-非機(jī)械法；物理法（勻漿法、珠磨法、超聲法），化學(xué)法（滲透沖擊、增容法），生物法（酶溶法）。固液分離常用方法：離心沉淀，膜過濾，雙水相萃取。三、選擇分離純化方法的依據(jù)：1根據(jù)產(chǎn)物表達(dá)形式來選擇。2根據(jù)分離單元之間的銜接選擇。應(yīng)盡早采用高效分離手段，將含量最多的雜質(zhì)先分離去除，將最昂貴最費時的分離單元放在最后階段。色譜分離次序的選擇同樣重要，經(jīng)鹽析后的液體不適宜于離子交換層析，但對疏水層析則可直接應(yīng)用。離子交換、疏水及親和色譜通?？梢云鸬降鞍踪|(zhì)的濃縮的效應(yīng)。親和層析選擇性最強(qiáng)，多放在第二步以后。3根據(jù)分離純化工藝的要求來選擇1）應(yīng)具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。2）盡可能減少組成工藝的步驟。3）組成工藝的各技術(shù)或步驟之間要能相互適應(yīng)和協(xié)調(diào)，工藝和設(shè)備相適應(yīng)。4）在工藝過程中盡可能少用試劑，尤其是對穩(wěn)定性差的產(chǎn)物。5）分離純化工藝所用的時間盡可能短，尤其是對穩(wěn)定性差的產(chǎn)物。6）工藝和技術(shù)必須是高效，收率高，易操作，對設(shè)備條件要求低，能耗低。7）具有較高的安全性。四、分離純化的技術(shù)要求：1技術(shù)條件要溫和，能保持目的產(chǎn)物的生物活性。2選擇性要好，能從復(fù)雜的混合物中有效的將目的產(chǎn)物分離出來，達(dá)到較高的純化倍數(shù)。3收率要高。4兩個技術(shù)之間要能直接銜接，不需要對物料加以處理或調(diào)整。5整個分離純化過程要快，能夠滿足高生產(chǎn)率的要求。十七、包含體的分離、溶解和復(fù)性：細(xì)胞破碎固液相分離去污劑或低濃度尿素或鹽酸胍去除可溶性蛋白和膜蛋白高濃度尿素或鹽酸胍溶解包含體，DTT打開二硫鍵逐步透析或稀釋去除變性劑。第三章 動物細(xì)胞工程制藥一、 如何選擇培養(yǎng)基（簡答題）：培養(yǎng)基的基本要求：營養(yǎng)成分，促生長因子，激素，滲透壓，PH，無毒無污染。1建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)該是這種細(xì)胞首選的培養(yǎng)基，查閱參考文獻(xiàn)，根據(jù)細(xì)胞株建議的培養(yǎng)基。2根據(jù)細(xì)胞株的特點和實驗要求選擇培養(yǎng)基。3用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細(xì)胞，觀察生長狀態(tài)，可以用生長曲線、集落形成率等指標(biāo)判斷，根據(jù)實驗結(jié)果選擇效果好的。二、 天然培養(yǎng)基：血清：成分：由血漿去除纖維蛋白而形成的，血清中含有各種多肽，脂肪，碳水化合物，生長因子，激素，無機(jī)物等。作用：1提供基本營養(yǎng)物質(zhì)。2提供激素和各種生長因子。3提供結(jié)合蛋白。4對培養(yǎng)基中的細(xì)胞起到某些保護(hù)作用。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：取材對象。取材過程。促生長效果?？寺⌒纬陕?。貼瓶率測定。續(xù)傳代培養(yǎng)。外觀：透明清亮，土黃或棕黃色。無沉淀或極少。渾濁沉淀多蛋白質(zhì)變性。棕紅色取材時有溶血現(xiàn)象。液體稀薄摻入生理鹽水過多。三、 合成培養(yǎng)基：人工設(shè)計，配制的培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基：優(yōu)點是成分明確，組分穩(wěn)定，可大量生產(chǎn)。氨基酸、維生素、糖類、無機(jī)鹽、其他成分（酚紅指示劑）。無血清培養(yǎng)基：即不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外較長時間繁殖的合成培養(yǎng)基。HamF12與DMEM1：1混合。優(yōu)點是1提高了細(xì)胞培養(yǎng)的可重復(fù)性，避免了血清批次之間差異的影響。2減少了有血清帶來的病毒真菌支原體等微生物污染的危險。3供應(yīng)充足，穩(wěn)定。4細(xì)胞產(chǎn)品易于純化。5避免了血清中某些因素對有些細(xì)胞的毒性。6減少了血清中蛋白對某些微生物測定的干擾，便于對實驗結(jié)果的分析。無蛋白培養(yǎng)基：不含有動物蛋白的培養(yǎng)基限定化學(xué)成分培養(yǎng)基：指培養(yǎng)基中所有成分都是明確的平衡鹽溶液：由無機(jī)鹽，葡萄糖組成。維持細(xì)胞滲透壓平衡，保持pH穩(wěn)定及提供簡單的營養(yǎng)。用于取材時組織塊的漂洗、細(xì)胞的漂洗、配制其它試劑。消化液：用于取材進(jìn)行原代培養(yǎng)時需要將組織塊消化解離形成細(xì)胞懸液。傳代培養(yǎng)時也需要將貼壁細(xì)胞從瓶壁上消化下來。EDTA溶液（破壞細(xì)胞間的連接），膠原酶溶液（上皮類細(xì)胞原代培養(yǎng)時使用），胰酶溶液（消化酪蛋白）添加的抗生素：青霉素（革蘭陽性菌），鏈霉素（革蘭陰性菌）細(xì)胞營養(yǎng)污染的原因途徑：空氣，器材，操作，血清，組織樣本。污染補(bǔ)救措施：抗生素排除法（有價值的細(xì)胞），加溫除菌（支原體污染），動物體內(nèi)接種（腫瘤細(xì)胞），與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)第四章 抗體制藥一 單克隆抗體：將抗體產(chǎn)生細(xì)胞與具有無限增殖能力的骨髓瘤細(xì)胞相融合，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細(xì)胞成為純一的單克隆細(xì)胞體系，此細(xì)胞系能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和特異性完全相同的高純度抗體。是針對一個抗原決定簇的抗體，又是單一的B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的，故稱單克隆抗體。（高度特異性，均一性，有穩(wěn)定來源可大量生產(chǎn)）二 B淋巴細(xì)胞及特點：B淋巴細(xì)胞受抗原刺激產(chǎn)生特異性抗體