益氣活血中藥延緩血管老化的作用與機制研究.ppt

1,益氣活血中藥延緩血管老化的 作用與機制研究,中國中醫(yī)科學院 雷 燕 陳可冀 等,973項目分課題之一,2,研究背景,血管老化（vascular aging）分為隨增齡所致的生理性血管老化和各種疾病引起的病理性血管老化，均表現(xiàn)血管在形態(tài)和功能上發(fā)生各種衰老變化，如僵硬度增加、順應性降低和動脈管壁增厚、血管內皮功能低下等 血管老化是人體衰老的關鍵始發(fā)因素，也是老齡人群心血管疾病風險增加的主要原因 衰老的過程其實是一個動脈進行性硬化的過程，動脈硬化是衰老的根本原因，對衰老起決定因素的是血管而非年齡,3,研究背景,目前我國老齡人口比例以每年3%的速度遞增,老齡人群具有心腦血管病發(fā)病率高的特點，高血壓病、冠心病、心功能不全、腦卒中等發(fā)生率隨增齡急劇上升，均存在著明顯的心血管老化的表現(xiàn)，即心血管系統(tǒng)結構和功能發(fā)生特征性改變 隨增齡出現(xiàn)的血管老化問題已成為研究心血管病危險因素及防治的新靶點，開展心血管衰老的中醫(yī)藥干預研究，對延緩血管老化，防治心腦血管疾病具有重要意義,4,血管老化屬于血管病變的一種，可由增齡、高脂飲食、運動減少、高血壓、糖尿病、肥胖等原因引起，老化的血管病理學表現(xiàn)為血管內膜增厚、血管硬化和動脈血壓改變 隨著對血管病變認識的深入, 已知血管壁病變而不是管腔病變的發(fā)生發(fā)展才是各種心血管事件發(fā)生的基礎；在細胞和分子水平，血管老化表現(xiàn)在血管內皮細胞、平滑肌細胞和胞外基質水平的改變 血管老化改變了各種心血管疾病的病理生理機制，從而改變了疾病發(fā)生的閾值、嚴重程度和預后,老齡及血管老化概述,老齡及血管老化概述,血管老化與血管病變,5,血管老化de主要表現(xiàn),脈搏波速度(PwV) 是評價血管硬度的較好指標 脈壓增大是反映血管硬化的一項重要指標 頸總動脈內徑反映血管壁彈性與伸展性隨年齡而下降,是衰老的標志 踝臂指數(shù)(ABI)作為評估血管功能的指標，其降低反映AS 晚期糖基化終產物(AGE)隨增齡在體內積累，是老年病的病理基礎之一 活性氧(ROS)水平異常增高在介導血管衰老中居于重要的地位 腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS) 調節(jié)血管細胞的凋亡、VSMC 遷移、炎性反應及ECM重建等，Ang是RAS的功能多肽 基質金屬蛋白酶（MMP-2)與其抑制劑(TIMP-2) 比值的調節(jié)可以控制血管重構的發(fā)生、發(fā)展,6,中醫(yī)學對血管衰老的認識,認為虛損致衰。氣（腎）虛夾瘀阻絡是血管衰老的基本病機；延緩衰老應補虛祛瘀法并用 心血管疾病的基礎病變和共同歸路是血管老化，也是多種血管病變在“入絡”階段異病同治的病理基礎 益氣活血藥人參、三七是常見的具有抗衰老作用的天然藥物，均富含三萜類達瑪烷型皂甙，國內外藥理研究已證實此類有效成分有抗衰老作用，可達到益氣活血，祛瘀生新，通脈活絡的作用,7,研究目的,以自然衰老小鼠為模型，觀察衰老小鼠血管老化所導致血管壁結構和功能的改變，闡明血管衰老的可能機制 通過復制內皮細胞( EC) 模型，揭示血管細胞衰老機制 觀察益氣活血中藥能否通過產生ROS的NADPH氧化酶亞單位p47phox的途徑延緩血管老化 揭示益氣活血中藥人參三七川芎提取物延緩血管老化的作用和機制,8,研究方法,模型：健康雄性自然衰老小鼠，14月齡，70只 復制衰老血管內皮細胞（EC）模型 分組：衰老模型組、人參三七川芎高、中、低劑量組、 維生素E組（VitE組）、另設青年對照組 給藥：按照小鼠和人體重劑量折算系數(shù)關系，中藥大、 中、小劑量相當于臨床用量的2倍、1.5倍、1倍， 維生素E50.0 mg/（kgd），給藥3個月,9,實驗藥物 中藥制備： 人參、三七、川芎 按比例加入3倍70乙醇提取3次，將醇提取液進行乙醇回收，濃縮至無醇味，制成中藥浸膏，含3.164 g生藥/g浸膏 對照藥： 維生素E 購自Sigma公司,10,研究內容,觀察指標,11,益氣活血藥延緩血管老化的實驗研究 EC部分,4代 5代 7代,8代 10代 11代,各代內皮細胞生長狀況的比較,12,益氣活血藥延緩血管老化-EC形態(tài)學觀察,中藥高劑量組 中藥低劑量組 光鏡 100,8代對照組 VitE組,第8代自然衰老細胞，中藥高劑量和VitE 組細胞較衰老模型組光鏡下觀察， 內皮細胞生長狀態(tài)好，數(shù)量較多，增殖較旺盛,13,益氣活血藥延緩血管老化-內皮細胞B-gal染色,中藥高劑量組 中藥低劑量組 光鏡x400,8代對照組 VitE組,8代模型衰老組表達B-gal藍染細胞較多，約78%左右；VitE組陽性細胞數(shù)約25% 左右；中藥高劑量組約42%左右，低劑量組約38%左右,14,細 胞 周 期,8代衰老組 VitE組,中藥高劑量組 中藥低劑量組,15,細 胞 周 期,與VitE組比較, 8代衰老模型組細胞周期向G0-G1期明顯停頓，G2-M期細胞明顯減少；與衰老模型組比較，中藥高、低劑量組及Vit E組G0- G1期細胞明顯減少，處于G2-M期的細胞明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義；表明中藥在一定程度上能夠延緩細胞衰老，促進細胞增殖,16,益氣活血藥延緩血管老化-細胞內ROS含量（激光共聚焦）,8代模型組 VitE組,中藥高劑量組 中藥低劑量組 激光共聚焦x100,中藥高、低劑量和VitE組熒光強度較模型組明顯減弱；提示中藥可通過減少細胞內活性氧產生，延緩細胞衰老,17,細胞培養(yǎng)液抗超氧陰離子與NO含量,8代衰老模型組抗超氧陰離子和NO含量明顯減少（P0.05）；中藥高、低劑量組抗超氧陰離子和NO含量比衰老組明顯增加，但較VitE組含量降低，差異有統(tǒng)計學意義。提示8代衰老EC抗氧化能力下降，而中藥能在一定程度上改善內皮的功能，增強抗氧化能力，從而延緩細胞衰老,18,細胞p47phox、AT1R、AT2R蛋白表達,與VitE組比較，8代衰老組p47phox，AT1R，AT2R表達明顯上調；與8代衰老組比較，中藥兩組與Vit E組p47phox表達明顯下調，AT1R，AT2R表達明顯下調；與Vit E組比較，中藥兩組p47phox，AT2R表達上調，AT1R表達僅有上調趨勢，無明顯差異,19,益氣活血藥延緩血管老化的整體研究（1）,一般情況 各組小鼠生活狀況良好，體質量正常。青年組小鼠體毛白且光澤，行動活潑，反應靈敏；其余各組小鼠體毛較青年組顏色稍暗，動作稍遲緩；14月齡模型組小鼠，體毛蓬松，沒有光澤，運動減少，動作相對較遲緩,20,益氣活血藥延緩血管老化的整體研究（2）,中藥中劑量組 中藥低劑量組 維生素E組 HE x100,青年對照組 衰老模型組 中藥高劑量組,各組小鼠主動脈形態(tài)學比較 衰老模型組小鼠血管壁出現(xiàn)典型的衰老表現(xiàn)，給予中藥后的小鼠血管內膜中膜增厚不明顯，內皮細胞脫落減少，僅有部分平滑肌細胞向內膜遷移，衰老改變不顯著,21,益氣活血藥延緩血管老化的整體研究（3）,各組小鼠主動脈Masson染色結果比較 衰老模型組小鼠血管壁平滑肌和膠原含量明顯增多，給予中藥后膠原增生明顯減少，高劑量組可使平滑肌細胞增生明顯減少，衰老小鼠血管老化相對減緩,青年對照組 衰老模型組 中藥高劑量組,中藥中劑量組 中藥低劑量組 維生素E組 Masson染色x100）,22,主動脈Masson 染色及SMC、CF相對含量(面積)比較,益氣活血藥延緩血管老化的整體研究（4）,注：與對照組比較，*P0.05；與模型組比較，P0.05，下表同 衰老模型組小鼠血管壁平滑肌和膠原含量明顯增多，給予中藥后膠原增生明顯減少，高劑量組可使平滑肌細胞增生明顯減少，衰老小鼠血管老化相對減緩,23,益氣活血藥延緩血管老化的整體研究（5）,各組血管組織抗超氧陰離子、血漿Ang含量比較,注：與對照組比較，*P0.05；與模型組比較，P0.05，下表同,中藥灌胃后，小鼠血管組織中的抗活性氧生成能力比衰老模型組有一定程度的增強，說明益氣活血藥可能通過減少活性氧的生成來延緩血管老化。衰老模型組Ang含量最低，對照組最高，說明血漿中Ang含量與血管老化的關系不密切，應進一步檢測血管組織中Ang含量，確定與血管老化的關系,24,各組血管組織中AGEs含量及MMP-2/TIMP-2比值比較,注：與對照組比較，*P0.05；與模型組比較，P0.05 青年小鼠AGEs含量較少，而老年小鼠AGEs含量較多，給予中藥灌胃后，老年鼠血管中AGEs含量有不同程度的降低，說明益氣活血藥在一定程度上降低動脈僵硬度，從而延緩血管的老化。而衰老模型組MMP-2 、MMP-2/ TIMP-2最高，TIMP-2含量最低，表明衰老小鼠已出現(xiàn)年齡相關的血管重構，中藥各組小鼠MMP-2 、MMP-2/ TIMP-2明顯降低，表明中藥可能通過抑制MMP-2生成、增強TIMP-2的活性，減少血管壁EMC降解，從而延緩血管老化,益氣活血藥延緩血管老化的整體研究（6）,25,研究結果及進展,人參三七川芎能夠改善衰老小鼠主動脈形態(tài)學衰老變化，降低血管組織中活性氧的生成，減少AGEs生成，抑制MMP-2的活性，調節(jié)MMP-2/TIMP-2的平衡 人參三七川芎具有延緩血管老化的作用，可能是通過影響NADPH氧化酶減少ROS（活性氧）的生成，從而達到延緩血管老化的目的,26,結 論,衰老小鼠血管在結構和功能上都出現(xiàn)了明顯的衰老改變：血管內膜中膜增厚，管壁平滑肌和膠原含量明顯增多，血管組織中AGEs含量增多，而抗活性氧生成能力降低，MMP-2/ TIMP-2比值增高，表明衰老小鼠血管組織已出現(xiàn)年齡相關的血管重構 人參三七川芎提取物能降低衰老小鼠血管的僵硬度、減少血管重構，延緩小鼠血管老化的發(fā)生,27,下一步工作打算,擬進行血管老化的臨床特征調查和益